2  结果

　　2.1  成功构建pGCU6-ITGαv和pGCU6-ITGβ3 siRNAs重组质粒  首先合成编码siRNA模板链DNA，与线性化pGCsilencer U6在T4连接酶作用下连接，转化感受态细胞JM109，筛选阳性质粒，小量提取，酶切鉴定，测序结果与设计序列完全一致。

　　2.2  重组质粒特异性抑制整合素 αvβ3在HRCECs细胞中的表达。

　　2.2.1   整合素 αvβ3蛋白分析  图1。Western印迹结果显示，正常对照组中整合素 αv和β3未见明显表达；而在缺氧对照组中，整合素 αv和β3表达明显增加；空载体对照组与缺氧对照组相比，表达无明显差别；si-αv组和si-β3 组与缺氧对照组相比，整合素αv和β3表达明显减少，抑制率为56.05%，有显著性差异（P＜0.05）。GAPDH表达在各组中无明显差异，说明siRNA-整合素 αvβ3对整合素 αvβ3的抑制作用是特异性的。

　　1：Marker；2：缺氧对照组；3：空载体转染组；4：si-整合素αv组1：Marker；2：缺氧对照组；3：空载体转染组；4：si-整合素β3组

　　图1  HRCECs中整合素αvβ3蛋白的表达（略）

　　2.2.2   整合素 αvβ3 mRNA分析  RT-PCR结果显示，正常对照组中整合素 αv和β3未见明显表达；而在缺氧对照组中，整合素 αv和β3表达明显增加；空载体对照组与缺氧对照组相比表达无明显差别；si-整合素αv组和si-整合素β3 组与缺氧对照组相比，整合素 αv和整合素 β3表达明显减少，抑制率为60.25%，有显著性差异（P＜0.05）。GAPDH表达在各组中无明显差异，说明si-整合素 αvβ3对整合素 αvβ3的抑制作用是特异性的（图2）。

　　M：Marker；1：正常对照组；2：缺氧对照组；3：空载体转染组；4：si-整合素αv组；5：si-整合素β3组

　　图2  转染HRCECs中整合素 αvβ3 mRNA 的表达情况（略）

　　3  讨论
   
　　视网膜新生血管形成是糖尿病性视网膜病变等缺血、缺氧性眼疾病共同的病理过程，也是老年人常见的眼底出血及视力下降的原因之一。视网膜新生血管形成是个极其复杂的过程，通常认为当视网膜缺血缺氧时，在各种生长因子及细胞因子的刺激下，已经存在的微血管网内皮细胞发生有丝分裂、迁移，以出芽的方式形成管腔。如能有效地打断这一环节,新生血管将无法形成〔6〕。
   
　　整合素是一类细胞表面受体家族,其中整合素αvβ3在新生血管内皮细胞有高度表达，αvβ3与配体结合后通过丝裂原激活的蛋白激酶途径使内皮细胞增殖、分化和迁移形成血管。因此，整合素αvβ3逐渐被认为是新生血管组织的标记物。已有实验证明缺氧可诱导整合素αvβ3表达的增高，而缺氧调节整合素αvβ3基因的表达是血管形成的重要调节因子。尽管众多资料显示整合素与血管生成密切相关，但其确切机制尚不清楚，可能与生长因子受体激活途径相整合，与PKC，Ras/shc/MAPK ，FAK等信号分子相互作用，调节细胞骨架和血管生成相关基因以及血管内皮细胞整合素受体的表达，影响内皮细胞和细胞外基质的相互作用，从而影响血管内皮细胞的生长或迁移〔7〕。
   
　　本实验应用RNA干涉技术设计构建了针对整合素αvβ3 mRNA的siRNA重组质粒，转染到已建立缺氧模型的HRCECs中，观察重组质粒对整合素αvβ3表达的影响〔8〕。RT-PCR、Western印迹等证实上述质粒可在mRNA及蛋白质水平显著抑制整合素αvβ3表达，提示由U6启动子介导的整合素αvβ3 的干涉重组质粒,能够成功的抑制整合素αvβ3在HRCEC中的表达，从而为进一步研究整合素αvβ3基因在HRCEC中的功能奠定了基础，亦为临床上治疗人视网膜新生血管等眼缺血缺氧性疾病提供了一定的实验基础和理论依据。

　　【参考文献】

　　1 Polverini PJ.Cellular adhesion molecules：newly identified mediators of angiogenesis〔J〕.Am J Pathol,2006;14(8):1023-9.

　　2 Brooks PC.Roles of integrin in angiogenesis〔J〕.Eur J Cancer,2001:32（11）：2423-9.

　　3 Humphries MJ.Integrin structure 〔J〕.Biochem Soc Trans，2000;28(4):311-39.

　　4 Walton HL，Corjay MH，Mohamed SN，et al.Hypoxia induces differential expression of the integrin receptors alphavbeta3 and alphavbeta5 in cultured human endothelial cells〔J〕.J Cell Biochem,2000；78(4):674-80.

　　5 Ruegg C，Domondo O，Mariotti A.Endothelial cell integrins and cox-2 mediators and therapeautic targets of tumor angiogenesis 〔J〕.Biochim Biophys Acta，2004；16（5）：51-67.

　　6 Friedlander M，Brooks PC，Shaffer RW,et al.Definition of two angiogenic pathways by distinct αv integrins〔J〕.Science,1995；27（10）:1500-2.

　　7 Stromblad S，Cheresh DA.Integrins angiogenesis and vascular cell survival〔J〕.Chem Biol,2006；3（1）:881-5.

　　8 Ning S，Fuessel S，Kotzsch M,et al.siRNA-mediated down-regulation of STAT3 inhibits bladder cancer cell growth〔J〕.Int J Oncol，2004；25(4):1065-71.

上一页  [1] [2]