作者：戢维颖 作者单位：（710032）中国陕西省西安市，第四军医大学西京医院眼科 全军眼科研究所
【摘要】 研究将骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）诱导分化后在羊膜表面培养构建角膜上皮移植片的可行性。方法：取SD大鼠骨髓间充质干细胞和角膜基质细胞，分别培养并传2代后进行共培养，取共培养7d后的MSC覆载于新鲜人羊膜，再培养7d。对MSC及诱导后MSC进行免疫荧光染色和扫描电镜检查；对覆载细胞的羊膜进行HE染色及免疫荧光染色。结果：MSC在体外培养条件下贴壁生长，免疫荧光染色CD29和CD44阳性，CK12阴性。经角膜基质细胞诱导分化后，MSC细胞CK12染色转为阳性。诱导后MSC接种到羊膜表面，迅速贴壁生长，组织学特性无明显改变，CK12染色仍为阳性。结论：经角膜基质细胞诱导的MSC表现出角膜上皮细胞特征，在羊膜上生长后保持不变。
【关键词】 骨髓间充质干细胞 皮细胞 羊膜 角膜上皮移植片
0引言
眼表由角膜上皮、结膜上皮和泪膜3部分组成，眼表的稳定对维持角膜的透明性具有非常重要的作用。其中，角膜上皮再生的来源是角膜缘干细胞，而由于外伤、炎症、变性等疾病造成的眼表损伤，会导致角膜缘干细胞的大量缺失，从而引起角膜新生血管长入，角膜瘢痕形成。目前临床针对这类眼表疾病多采取单纯羊膜移植、羊膜联合角膜缘干细胞移植、板层角膜移植联合角膜缘干细胞移植、角膜缘干细胞移植联合穿透性角膜移植这几类手术方法，但以自体或同种异体角膜缘移植，因供体来源不足及异体移植引起的排斥反应而受限；而单纯羊膜移植重建眼表，因无上皮再生来源的干细胞而不能治疗角膜缘严重受损的眼表损伤。因此，构建一个完整的角膜上皮移植片成为解决这一问题的关键。组织工程技术的发展给治疗这一类疾病带来了希望，近期研究表明骨髓间充质干细胞具有分化为上皮细胞的潜能。我们探讨MSC作为种子细胞，经角膜基质细胞诱导分化为角膜上皮细胞后，种植于羊膜表面，与羊膜共同构建角膜上皮移植片的可行性。
1材料和方法
1.1材料
清洁级SD大鼠。低糖DMEM培养基及胎牛血清（Gibco），细胞培养基（DMEM，10mL/L胎牛血清）；角蛋白多克隆抗体cytokeratin13（鼠抗人）、cytokeratin12（兔抗鼠）及山羊抗兔FITC标记荧光二抗购于美国Gibco公司，罗丹明标记荧光二抗购于Santa公司。Transwell小室（美国Millipore公司）。
1.2方法
按文献[1]方法并加以改进来分离和培养大鼠间充质干细胞。取2wk龄SD大鼠，雌雄不限，断颈处死后在750mL/L乙醇中浸泡10min，无菌条件下，分离皮肤及肌肉，暴露骨髓腔，用DMEM液反复冲洗骨髓腔，将冲出的液体收集于培养皿，过筛、离心后制成单细胞悬液，按1×107/L密度接种于75mL培养瓶，加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基，24h换液去除未贴壁细胞，以后每2～3d换液，换液前PBS洗去部分未贴壁细胞，每日倒置相差显微镜观察细胞形态及生长状况，当70%～80％细胞达到融合时用2.5g/L胰蛋白酶消化传代，进行扩增培养。取生长为2代的MSC接种于预置在24孔板内的无菌盖玻片上，当细胞生长2～3d基本融合时，取出，用40g/L多聚甲醛固定30 min，制成细胞爬片，行CD44，CD45，CD29直接免疫细胞荧光化学染色，同时用PBS代替一抗作为空白对照[1]。取1wk龄SD大鼠，雌雄不限，断颈处死后在750mL/L乙醇中浸泡10min，于无菌条件下取大鼠眼球，显微镜下剪取角膜中央区域，将角膜剪碎成约为1mm×1mm的小块后放入离心管，加入胶原酶1mL，放入温箱消化1h，过筛、离心后加入培养基，制成细胞悬液，按1×106/L密度接种于培养瓶中，48h换液，以后每2 ～3d换液，每日倒置相差显微镜观察细胞形态及生长状况，待细胞生长70%～80%基本融合时用2.5g/L胰蛋白酶消化传代。
1.2.1 MSC的诱导分化
取第2代的MSC与第2代的角膜基质细胞放置于Transwell体系中共培养，培养时6孔板下层接种MSC（5×105/L），上层接种角膜基质细胞（1×105/L），共培养体系上、下层细胞被隔开，培养液和可溶性因子可以自由通过。每日半量换液，置于50mL/L CO2,37°C培养箱中共培养7d，每日倒置像差显微镜观察细胞生长状况。将共培养7d的MSC用2.5g/L胰蛋白酶消化后，接种于预置在24孔板内的无菌盖玻片上，当细胞生长基本融合时，取出进行免疫细胞荧光染色：40g/L多聚甲醛固定，PBS溶液振洗3次，封闭血清封闭；每张爬片加入一抗（CK12）50μL，37°C孵育2h；PBS冲洗后每张爬片加入50μL山羊抗兔FITC标记荧光二抗，37°C避光孵育1h；PBS冲洗后用缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。对照组为PBS溶液代替一抗。另细胞爬片用20g/L戊二醛固定，扫描电镜观察。
1.2.2诱导后MSC接种于羊膜上培养
先在无菌条件下取健康足月剖腹产产妇的羊膜，用含1×106U/L庆大霉素的无菌生理盐水洗去血迹，浸泡40min，在无菌条件下操作，去除滋养层，将羊膜修剪成大小约为3cm×3cm的组织块，分装于培养皿后冻存于－80°C冰箱保存备用。用前常温解冻，水化后PBS冲洗，2.5g/L胰蛋白酶37°C培养箱消化1h，去除海绵层及纤维母细胞层，PBS反复冲洗后，将上皮面朝上铺于不锈钢支架上备用。消化的羊膜经HE染色，为纤维结构，无细胞残留。将共培养7d Transwell体系中的MSC消化后，以1×106/L密度接种于上皮面向上的羊膜表面，置50mL/L CO2,37°C培养箱贴壁4h后加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基，以后每2d换液，共培养7d，形成上皮细胞片。每日倒置相差显微镜观察细胞生长情况。将未诱导MSC覆载于羊膜作为诱导的阴性对照。另取覆载MSC培养7d的羊膜（上皮细胞片），用40g/L多聚甲醛固定，同上文进行角膜上皮样细胞免疫荧光鉴定，对照组为PBS代替一抗；另取部分羊膜做切片和HE染色。
2结果
2.1 MSC的培养和鉴定
原代MSC 24h后贴壁，完全伸展，呈梭形、多角形，形态不规则，小部分呈圆形的造血细胞经PBS冲洗后弃除。培养7d细胞基本融合后传代，经2次传代，P2代细胞形态为成纤维细胞样，胞体呈长梭形，核为椭圆形，形态一致，倒置显微镜下观察呈漩涡状、辐射状排列（图1A），细胞生长迅速，4～5d传代。取P2代细胞行细胞表面标志荧光染色，结果显示CD29，CD44呈阳性[1]（图1B），CD34，CD45阴性，角蛋白CK12染色阴性。扫描电镜下，显示细胞呈长梭形的纤维细胞样，细胞突丰富（图1C），以上符合骨髓MSC特征。
2.2 MSC的诱导分化
MSC与角膜基质细胞共培养7d后，诱导后的MSC在倒置显微镜下观察，可见细胞形态多呈四角形，扁平，形态变大，长梭形细胞减少（图2A）；免疫荧光染色检查示细胞表面角蛋白CK12染色呈阳性（图2B）；扫描电镜检查，见大量上皮样细胞存在，细胞连成片状，细胞间紧密连接结构清晰，形态学分析此紧密连接为上皮细胞的特征性结构，提示MSC已转化为上皮细胞（图2C）；证实诱导后的MSC已定向分化为角膜上皮细胞。
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