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2.3上皮细胞片的观察与鉴定
诱导后的MSC按1×106/L的密度接种于羊膜，4 h开始贴壁，24 ～48h细胞完全伸展，倒置像差显微镜下观察细胞生长迅速、折光度强、细胞活力好，3d已单层融合，细胞形态清楚，与接种前未发生明显形态学改变（图3A，B）， 5～7d开始形成复层上皮样结构，细胞结构仍清晰，10d细胞生长过于密集，结构不清，老化细胞增多，以7 d的细胞密度较为合适。HE染色结果可见羊膜胶原纤维上有上皮细胞生长，组织结构紧凑，HE颜色对比清晰，细胞与羊膜间连接紧密（图3C）。行CK12免疫荧光染色细胞呈阳性反应（图3D）。
3讨论
眼表的稳定性对维持角膜的透明性具有非常重要的作用，当眼表发生损伤时，易引起角膜上皮结膜化、角膜新生血管、角膜上皮缺损、持续性角膜溃疡、角膜瘢痕形成等一系列改变。轻度的眼表损伤行角膜缘干细胞移植等方法，可获得一定疗效，但当发生双眼严重的眼表损伤时，由于缺乏健康的角膜缘干细胞和角膜供体来源，目前尚无有效的治疗方法。我们的目的是为组织工程角膜寻找一种更好的途径，将骨髓间充质干细胞作为种子细胞，和羊膜一起构建一个完整健康的角膜上皮移植片，为自体移植打下基础。骨髓间充质干细胞是一种存在于骨髓中具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体，在体外不同诱导条件下可转化为多种不同类型的细胞[2,3]，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等中、内、外胚层细胞[46]，易于获得，可于体外进行扩增培养的特点，使MSC成为新的种子细胞，国外研究发现MSC同时具有编码内皮和上皮组织的基因[7]。同时国内近期研究报道显示，MSC可在体外诱导分化为上皮细胞，体内实验研究表明MSC在体内的微环境下具有分化为上皮细胞的潜能[8]，且我们的前期研究已经也表明MSC有分化为上皮样细胞的潜能[1]。角膜基质是角膜上皮细胞和角膜缘干细胞的微环境，有维持角膜上皮细胞特性的作用，含有多种自分泌和旁分泌细胞因子及其受体，共同组成了角膜缘基质层复杂的细胞因子调控环境，维持角膜缘干细胞的正常分化，所以本实验利用自体角膜基质细胞给MSC提供生长的微环境，观察MSC诱导后分化为角膜上皮样细胞的情况：扫描电镜显示诱导后的MSC呈上皮样细胞结构存在，细胞连成片状，连接紧密；细胞表面角蛋白CK12呈阳性，证明已转化为角膜上皮细胞，具有上皮细胞的特征。
我们采用羊膜为细胞生长平台，因为羊膜是半透明组织，可提供连续的基底膜，含有与角膜基质相同的板层体，及VII型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和各种整合蛋白[9]。层粘连蛋白有利于细胞的贴附，给细胞提供了良好的体外生长微环境。近年来，Tsai等[10]将健眼角膜缘上皮组织种植于羊膜上，体外培养2～3wk后植回患眼，随访15mo，6例中有5例视力得到明显提高。Koizumi等[1113]证实用去除上皮细胞的羊膜以及3T3细胞做饲养细胞培养角膜缘干细胞，移植术后可以获得更好的效果。但近年来的研究多为异体移植，对移植片的排斥也成为治疗效果一大难题。我们显示：将诱导后的MSC接种于羊膜（在羊膜制备过程中，去除上皮层、纤维母细胞层和海绵层，以利于细胞更好的贴附）后，细胞很快贴壁，经组织学和免疫细胞化学检查，细胞形态及其表面标志均未发生改变，CK12仍呈阳性。我们结果提示羊膜可作为诱导后MSC的细胞覆载体，作为细胞生长平台，不改变细胞本身的形态及性质，对其分化不产生影响，便于在手术中直接应用覆盖固定在受损伤的角膜上，为下一步活体动物眼表重建提供了材料。
综上所述，培养角膜上皮细胞进行自体移植是治疗眼表疾病的理想方法，既避免了异体移植免疫排斥等问题，又避免了健眼取材细胞量少、对健眼造成损伤的问题。我们利用组织工程技术外体培养自体MSC，诱导分化为角膜上皮细胞，取材方便，细胞量大，与羊膜一起构建自体的角膜上皮移植片，也便于应用，经进一步的动物实验验证后，可能为治疗角膜缘干细胞缺乏、眼表严重损伤的角膜疾病提供了新的治疗途径。
【参考文献】
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4 Popckop DJ, Azizi SA, Colter F. Potential use of stem cells from bone marrow to repair the extracellular matrix and the central nervous system. Biochem Soc Trans 2000;28(4):341345
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6 Krause DS, Theise ND, Collector MI, et al. MutiOrgan, mutiLineage engraftment by a single bone marrow derived stem cell. Cell 2001;105(3):369377
7 Tremain N, Korkko J, Ibberson D, et al. MicroSAGE analysis of 2353 expressed genes in a single cellderived colony of undifferentiated human mesenchymal stem cells reveal mRNAs of multiple cell lineages. Stem Cells2001;19(5):408418
8黄丹平，葛坚，高楠，等.诱导骨髓间充质干细胞分化为角膜上皮样细胞的初步研究.中国病理生理杂志 2007;23(5):9991003
9 Fukuda K, Chikama T, Nakamura M, et al. Differential distribution of subchains of the basement membrane components type IV collagen and laminin among the amniotic membrane, cornea and conjunctiva. Cornea 1999;18(1):7379
10 Tsai RJ, Li LM, Chen JK. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelia cells. N Engl J Med 2000;343(2):136138
11 Koizumi N, Inatomi T, Quantock AJ, et al. Amniotic membrane as a substrate for cultivating limbal corneal epithelial cells for autologous transplantation in rabbits. Cornea2000;19(1):6571 上一页 [1] [2] |
