作者：王玉    作者单位：温州医学院附属眼视光医院，浙江 温州 325027；

    【摘要】  目的 用抗树突状细胞单克隆抗体（anti-dendritic cell monoclonal antibody，DC-McAb）抑制树突状细胞（dendritic cell，DC），观察其对大鼠角膜移植排斥反应及植片内IFN-γ mRNA的表达、血清IL-2水平的影响。方法 以Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体，分A：对照组；A0：阳性对照组；B：腹腔给药组；C：结膜下给药组；D：保留受体上皮瓣组。A、A0、B、C组予常规穿透角膜移植术，D组保留受体上皮瓣。每组术前3 d及术日，术后第1、第2、第3、第5、第7、第9、第11天给药，A组：腹腔注射灭菌注射用水0.5 ml，A0组：腹腔注射小鼠抗大鼠IgG 0.1 ml+灭菌注射用水0.4 ml，B、D组：DC-McAb 0.1 ml+灭菌注射用水0.4 ml，C组：结膜下注射DC-McAb 0.05 ml。术后裂隙灯显微镜观察排斥反应情况，记录各组角膜发生排斥反应的时间。A、B、C、D组分别于术后第3、第7、第14和第21天采血清，ELISA法测IL-2水平。A、B组术后第7天取角膜植片，RT-PCR法检测IFN-γ mRNA的表达情况。结果 A组术后（7.63±0.74）d 出现排斥反应，A0组（7.50±0.54）d，与A组相比差异无显著性（P>0.05）；B组（17.11±1.17）d、C组（13.86±0.69）d、D组（17.88±0.84）d，与A组相比差异有显著性（P<0.01）；C组与B、D组 相比，差异有显著性（P<0.01）；B组与D组相比，差异无显著性(P>0.05)。A组角膜植片IFN-γmRNA可检测到有较高表达，B组的表达量很少或检测不到，两组之间的差异较为明显。正常SD大鼠血清IL-2浓度为(35.18±2.59)pg/ml，移植术后3 d略有升高，7 d时明显升高，14 d时IL-2的水平达高峰，21 d时下降，B、C、D组升高幅度与A组相比明显减少（P<0.05），C组与B、D组相比升高幅度较大（P<0.05），B、D两组之间无明显差异（P>0.05）。结论 抗树突状细胞单克隆抗体可抑制大鼠角膜移植排斥反应，延长角膜植片存活时间。

    【关键词】  单克隆抗体 药理学 角膜移植 干扰素Ⅱ型 白细胞介素2

    免疫排斥反应是角膜移植失败的主要原因。移植排斥反应发生时，异体抗原经抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）加工处理后呈递给T细胞。树突状细胞（dendritic cell，DC）是由美国学者Steinmann于1973年发现的，是目前所知的机体内功能最强的抗原提呈细胞，其抗原提呈功能较巨噬细胞（macrophages，MФ）及B淋巴细胞强10～100倍，因此，DC是机体免疫应答的始动者，在免疫应答的诱导中具有独特的地位。本研究拟用抗树突状细胞单克隆抗体（DC-McAb）抑制DC，观察其对角膜移植排斥反应的影响。在角膜中树突状细胞主要存在于角膜上皮层及浅基质层，因此本研究同时也拟比较保留受体上皮瓣与常规穿透角膜移植之间有无不同结果。

    自1986年Ｔ辅助细胞的Th1/Th2模式提出以来，细胞因子网络与移植排斥反应的关系以及其影响移植物存活时间的机制一直是移植领域的研究热点。Th1细胞主要分泌白细胞介素2（intrerleukin-2，IL-2）、干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），主要介导细胞免疫应答，在抗感染、器官移植排斥反应和自身免疫病的诱导过程中起重要作用。目前认为IFN-γ的基因表达，对预测急性排斥反应的发生具有一定价值，因此本实验用RT-PCR的方法检测角膜移植术后植片内IFN-γ的表达情况，从基因水平验证抗DC单抗对排斥反应的影响。角膜移植与其他器官移植有所不同的是移植的组织较小，这么小的角膜植片是否会导致血清细胞因子水平的改变呢？我们用ELISA的方法检测了大鼠角膜移植术前后血清  IL-2的浓度及经抗DC单抗治疗后的浓度水平。

    1  材料和方法

    1.1  动物  Wistar大鼠59只为供体，SD大鼠118只为受体，另4只SD大鼠未手术作空白对照。封闭群，雌性，250～270 g，清洁级，由中国科学院上海实验动物中心提供。

    1.2  主要试剂  DC-McAb由江苏大学医学技术学院免疫教研室提供；TRIzol (Invitrogen Life Technologies，USA)；RNA酶抑制剂（Promega，USA）；MMLV反转录酶（Promega）；Taq聚合酶（Promega）；IFN-γ特异引物对(上海博亚生物技术有限公司)：5'CCCTCTCTGGCTGTTACTGC3'， 5'CTCCTTTTCCGCTTC CTTAG3' 419 bp；鼠IL-2 ELISA试剂盒（96孔板，晶美公司）。

    1.3  手术方法  50只SD大鼠随机均分为A：对照组，A0：阳性对照组，B：腹腔给药组，C：结膜下给药组，D：保留受体上皮瓣组。角膜移植手术均在受体鼠右眼进行。对A、A0、B、C组行常规穿透角膜移植术，直径为3.5 mm。D组先用20%酒精制作角膜上皮瓣，将直径为4 mm酒精槽轻放于角膜中央，加满酒精，停留1 min后，用棉签吸去酒精，世可溶液冲洗，掀起上皮瓣后，用环钻钻出植床，植入用同样方法制作的、已去除上皮的植片，复位受体上皮瓣，以10-0尼龙线间断缝合。术前3 d及术后予3%洁霉素滴眼液，每日3次。术后不拆线。

    每组术前第3天及术日，术后第1、第2、第3、第5、第7、第9、第11天给药，A组：腹腔注射灭菌注射用水0.5 ml，A0组：腹腔注射小鼠抗大鼠IgG 0.1 ml+灭菌注射用水0.4 ml，B、D组：DC-McAb 0.1 ml+灭菌注射用水0.4 ml，C组：结膜下注射DC-McAb 0.05 ml。

    1.4  裂隙灯显微镜观察  术后每天行裂隙灯显微镜检查， 观察植床新生血管、植片水肿及混浊等指标，参考Holland等[1]制定的标准，记录移植排斥指数(rejection index，RI)(0～12分)。①角膜混浊：透明为0分；植片轻度混浊为1分；混浊加重，但仍可见前房者为2分；前房看不清者为3分；完全混浊为4分。②角膜水肿：植片无水肿为0分，基质轻度增厚为1分，弥漫性基质水肿为2分，出现上皮小水泡为3分，大泡性角膜病变为4分。③新生血管：无新生血管为0分，植床周边有新生血管为1分，新生血管达植片边缘为2分，新生血管入植片中周部为3分，新生血管布满植片为4分。以角膜混浊、水肿和新生血管3项评分之和为RI，当RI≥6时，为角膜排斥反应发生。记录各组角膜排斥发生的时间。

    1.5  植片内IFN-γ mRNA的表达  4只SD大鼠均分为A、B组，手术方式、用药同前A、B组。移植术后第7天，取角膜植片，用RT-PCR方法检测植片中IFN-γ的表达。①TRIzol提取总RNA。②MMLV逆转录酶和逆转录试剂盒进行逆转录反应操作。③FeroTec Gradien PCR基因扩增仪及PCR试剂盒进行PCR扩增。温度循环参数：30个PCR循环(94℃，1 min；退火温度65℃，1 min；72℃，1 min)；72℃延伸5 min。④PCR产物在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外透射反射仪下观察电泳结果。

    1.6  植片病理学观察  64只SD大鼠均分为A、B、C、D组，手术方式、用药同前A、B、C、D组。分别于术后第3、第7、第14和第21天每组各取4眼。取材时剪下角膜植片带少许植床，行常规HE染色，显微镜下观察。

    1.7  血清IL-2浓度的改变  取病理标本的同时，心脏采血1.5 ml，4只未手术SD大鼠作为空白对照。室温下静置20 min，自然凝固后，2 500 r/min离心20 min，取上清，用ELISA方法检测IL-2浓度。

    1.8  统计学方法  采用SPSS11.0统计软件进行成组资料的方差分析。

    2  结果

    2.1  排斥时间  排除了麻醉过量、虹膜嵌顿及前房出血等的病例，A组有8只，A0组有8只，B组有9只，C组有7只，D组有8只。晶状体混浊不影响结果的情况下可不排除。裂隙灯观察发现，术后前三天各组角膜植片均透明，有轻度水肿，角膜缘血管开始向中央生长，B、C、D组血管密度较A、A0组稀疏。随后A、A0组新生血管进展较快，血管密度相对较高，水肿加重，很快出现混浊，7～9 d时血管达植片周边，出现排斥反应。B、C、D组新生血管发展相对缓慢，血管也稀疏，有些角膜水肿还有减轻趋势，混浊发展较轻、较慢。A、A0组出现排斥反应后新生血管继续向角膜中央生长，血管增粗，像树枝状迂曲进展，角膜混浊水肿加剧。第21天时血管继续生长，混浊加重，但水肿减退。B、C及D组这一过程相对滞后，C组术后14 d左右出现排斥反应，B、D组17~18 d左右出现。由于前房炎症反应，有些晶状体在观察过程中出现逐渐混浊。各组统计结果如表1。

    A0组与A组相比，差异无显著性（P>0.05）；B、C、D组与A组相比，差异有显著性（P<0.01）；C组与B、D组相比，差异有显著性（P<0.01）；B组与D组相比，差异无显著性(P>0.05)。

    2.2  IFN-γ的电泳结果  图1显示了A、B两组IFN-γ mRNA的表达结果，可见角膜移植术后第7天时，A组角膜植片IFN-γ mRNA可检测到有高表达，而B组角膜植片IFN-γ mRNA的表达量很少或检测不到，两组之间的差异较为明显。

    2.3  HE染色观察  正常大鼠角膜较薄，可见上皮约有五层细胞，表面两层呈扁平样，中间两层稍厚，基底层呈立方形，上皮层约占整个角膜厚度的2/5。大鼠角膜缺乏前弹力层，基质层胶原纤维板层数较少，角膜基质细胞均匀分布于纤维板之间，核被染成深蓝色，后弹力层HE染色呈红色，内皮细胞单层，扁平样。A组移植术后第3天可见角膜植片轻度水肿，上皮脱落，角膜基质细胞消失，基质内一些多核白细胞浸润，有些标本植片植床交界处可见上皮增生，上皮层数增加至7～8层。第7天可见植片角膜上皮已生长，但仅2～3层，植床植片交界及植片周边角膜上皮增生可达8～9层。基质内见大量淋巴细胞、中性粒细胞及单核吞噬细胞浸润，周边可见新生血管，角膜基质水肿增厚，胶原纤维板层结构紊乱，内皮细胞减少，缝线周围可见异物反应样大量淋巴细胞环绕（见图2）。第14天见植片及周边植床上皮层继续增生甚至可达十多层，植片上皮可见空泡样改变及崩解坏死，基质胶原纤维板层结构已丧失，大量细胞浸润，大量新生血管，同时可见大量纤维细胞自植片周围向中央增生，多位于上皮下，角膜逐步瘢痕化，有些部位可见坏死改变，基质水肿进一步加重，后弹力层皱褶，内皮细胞基本不见。第21天可见上皮增生减弱，基质内纤维细胞进一步增多，细胞浸润及基质水肿较第14天减轻。B、C组与A组相比，第3天植片情况基本相同，但随后的发展较A组缓慢，且细胞浸润，基质水肿，新生血管程度相对较轻（见图3）。D组第3天时可见植片上皮存在，但仅有2～3层，余情况同B组。

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