作者：徐建森,孟瑞华,张杰,王景 作者单位：青岛大学医学院附属医院眼科，山东 青岛 266003
【摘要】 目的探讨神经调节蛋白1β （NRG1β）对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后的保护作用及对Bax表达的影响。方法制备大鼠视网膜缺血再灌注模型。将33只Wistar大鼠随机分为正常组（3只）、对照组（15只）、实验组（15只），于缺血再灌注开始时实验组大鼠玻璃体腔注射5 μL的NRG1β，对照组大鼠玻璃体腔注射平衡盐溶液5 μL。用核苷酸末端转移酶介导的dUTP末端标记法检测视网膜神细胞凋亡的变化，同时利用免疫组化方法检测Bax表达情况的变化。结果凋亡细胞主要出现在视网膜内核层及神经节细胞层,而外核层几乎无阳性表达。与对照组比较，实验组再灌注各时间点视网膜细胞凋亡数目显著减少(t=2.57～6.25,P＜0.01)，实验组再灌注各时间点Bax蛋白的表达显著降低(t=3.84～11.97,P＜0.01)。结论 NRG1β对视网膜缺血再灌注损伤具有明显保护作用，NRG1β抑制Bax的表达可能是其抑制视网膜缺血再灌注损伤后细胞凋亡的机制之一。
【关键词】 再灌注损伤；视网膜；神经调节蛋白类；bcl2相关X蛋白质
EFFECTS OF NEUREGULIN1β ON APOPTOSIS OF RETINAL CELLS AND EXPRESSION OF Bcl2ASSOCIATED X PROTEIN IN RATS WITH ISCHEMICAL REPERFUSION INJURY XU JIANSEN, MENG RUIHUA, ZHANG JIE, et al (Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); ［ABSTRACT］ Objective To investigate the protection of neuregulin1β (NRG1β) on retinal cells after ischemical reperfusion injury and the effects of NRG1β on the expression of Bax protein. Methods A model of retinal ischemia reperfusion in rat was made. Thirtythree wistar rats were divided into three groups as normal (three rats), control (15 rats) and experimental (15 rats). An injection of 5 μL of NRG1β into vitreous cavity of the rats in experimental group was offered, and 5 μL of BSS in the control group. Retinal paraffin sections were stained with TdTmediated dUTP nick end labeling to examine the apoptosis of retinal cells. The expression of Bax was detected immunohistochemically. Results Apoptotic cells mainly appeared in the inner nuclear and the ganglion cell layers, almost no positive expression was seen in the outer nuclear layer. Compared with the control group, the numbers of apoptotic cells and eressions of Bax in various time points in experimental group were significantly lower(t=2.57－11.97,P<0.01). Conclusion NRG1β shows a significant protection for retina with ischemical reperfusion injury. The inhibition of Bax by NRG1β may be one of the mechanisms preventing the apoptosis of this kind of retinal cell injury.
［KEY WORDS］ Reperfusion injury; Retina; Neuregulins; Bcl2associated X protein
视网膜缺血再灌注损伤（RIRI）是眼科临床上常见病理过程，也是目前缺血性眼病领域的研究热点，其实验动物模型的制备日臻成熟[1]，对缺血再灌注损伤机制的研究更全面，基因水平上的研究越来越完备，而最终针对各个可能的损伤机制而采取的保护和治疗措施正逐渐为我们所关注。有研究表明,早期的视网膜缺血再灌注是有益的,经过一定时间,缺血的视网膜并未出现明显功能障碍,但在再灌注后却出现了明显的功能障碍甚至不可逆损伤[2]。本研究利用线栓法制作RIRI模型，玻璃体腔注射神经调节蛋白1β（NRG1β）观察视网膜缺血再灌注前后Bax表达的情况,以探讨NRG1β及Bax在RIRI中的作用,为NRG1β对RIRI的治疗提供理论依据。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
成年Wistar大鼠33只,雌雄不限，体质量为180～240 g，由青岛市药物检验所动物中心提供。随机分为正常组（3只）、对照组（15只）、实验组（15只）。后两组根据灌注时间的不同再分为1、6、12、24、48 h组，所有动物均饲养在正常昼夜环境中。
1.2 主要试剂
TUNEL凋亡试剂盒、DAB显色试剂盒、SABC 试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，Bax多克隆抗体和多聚赖氨酸购自北京博奥森生物技术有限公司，NRG1β （纯度＞97%）由美国Morehouse School of Medicine公司生产。
1.3 动物模型的制备及药物干预方法
参照尹晓涛等[3]的方法制备Wistar大鼠RIRI模型。模型制备过程中用氧氟沙星滴眼液(泰利必妥，日本产)滴眼以保持角膜湿润及预防感染，同时保持大鼠肛温在37.0～37.3 ℃。在缺血完毕恢复再灌注初始，分别由左眼耳侧角巩膜缘进入玻璃体腔，实验组注入5 μL的NRG1β，对照组注入5 μL平衡盐溶液，将针头停留约15 s后拔出，以防药液渗漏。
1.4 标本采集与处理
大鼠分别于再灌注后1、6、12、24、48 h活体取材。摘除眼球后，沿角膜缘切开角膜去除晶状体，随后立即将眼球置于40 g/L的中性甲醛液中固定，时间＞24 h。取出组织块行常规脱水、透明、石蜡包埋并切片，片厚 5 μm。
1.5 TUNEL及Bax免疫组化染色
用TUNEL法检测凋亡神经细胞，检测程序严格按试剂盒操作说明进行；免疫组化法进行Bax染色，DAB显色，苏木精轻度复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察并照相。
1.6 统计学处理
采用SPSS 10.0及PPMS 1.5[4]软件对数据进行处理两样本均数比较采用t检验。
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