作者：王建明，宋艳萍，孙乃学，冯海晓，惠娜，范雅稚，胡凯 作者单位：1. 西安交通大学医学院第二附属医院眼科，陕西西安 710004；2. 西安市中心医院血液病研究所，陕西西安 710003
【摘要】 目的 探讨皮下注射重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin, rhEPO)对兔眼缺血再灌注损伤视网膜结构的保护作用。方法 24只健康日本大耳白兔任选一眼造成视网膜缺血再灌注损伤模型(模型组，共24眼)，对侧眼不作任何处理作为对照组(24眼)。另24只健康日本大耳白兔任选一眼造模(EPO组，共24眼)，于造模前第3天及造模结束时每只兔皮下注射rhEPO 100IU/kg各1次。于造模后第1、3、7、14天分别摘除每组各6只兔眼，观察视网膜组织结构形态、测量内层视网膜(inner retina layer, IRL)厚度并计数视网膜节细胞(retinal ganglion cell, RGC)。结果 自造模后第3天开始，模型组较对照组RGC数量减少、IRL厚度变薄(P<0.05，P<0.01)。自造模后第3天开始EPO组IRL较模型组厚(P<0.05，P<0.01)，自造模后第7天开始EPO组RGC数量较模型组多(P<0.05)。结论 rhEPO可以显著改善缺血再灌注损伤兔眼视网膜结构，可能成为一种神经缺血再灌注损伤的保护剂。
【关键词】 红细胞生成素 重组 视网膜 缺血再灌注 神经保护 兔
Recombinant human erythropoietin administration protects retinalstructure against ischemia and reperfusion injury in rabbits
WANG Jianming , SONG Yanping, SUN Naixue,FENG Haixiao, HUI Na, FAN Yazhi, HU Kai
1. Department of Ophthalmology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of
Xian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of Hematology,Xian Central Hospital, Xian 710003, China
ABSTRACT: Objective To investigate the neuroprotection of recombinant human erythropoietin (rhEPO) from retinal ischemia and reperfusion injury in rabbits. Methods Retinal ischemia and reperfusion injury models were made in one lateral eyes of 48 rabbits (24 in model group and 24 in EPO group). Contralateral eyes with no treatment in model group were as control (24 eyes). Hypodermic injection of rhEPO was performed 100IU/kg in EPO group rabbits. The retinal structure, the thickness of inner retina layer (IRL), and the amount of retinal ganglion cells (RGC) were then observed in 6 eyes of each group on day 1, 3, 7 and 14 after ischemia and reperfusion injury, respectively. Results There were fewer RGCs and less IRL thickness in model group than in control group 3 days after reperfusion (P<0.05, P<0.01). The IRL was more thick in EPO group than in model group 3 days after reperfusion (P<0.05, P<0.01). There were more RGCs in EPO group than in model group 7 days after reperfusion (P<0.05). Conclusion rhEPO can obviously improve the retinal structure following ischemia and reperfusion injury. rhEPO may be a novel drug for retinal neuroprotection.
KEY WORDS: erythropoietin; recombinant; retina; ischemia and reperfusion; neuroprotection; rabbit
青光眼、糖尿病性视网膜病变等多种眼病都可引起视网膜缺血再灌注损伤，导致严重的神经损害，目前尚无根本性的治疗药物。促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)因其能够通过刺激骨髓红系造血、缓解组织缺氧已经成为临床上疗效较好的治疗贫血药物。近来的研究表明EPO可能是一种新的视网膜神经保护药物[13]。本研究通过皮下注射重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin, rhEPO)，观察视网膜缺血再灌注后视网膜组织形态、内层视网膜(inner retina layer, IRL)厚度及视网膜节细胞(retinal ganglion cell, RGC)数量的变化，从组织结构上进一步探讨rhEPO对缺血再灌注损伤视网膜的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康日本大耳白兔48只，由西安交通大学实验动物中心提供，体重2.0～2.5kg，雌雄不限，裂隙灯显微镜及眼底镜检查眼部无异常。实验动物及实验使用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》。
1.2 视网膜缺血再灌注损伤模型的建立
采用生理盐水前房灌注法[3]造成视网膜缺血，然后恢复正常眼内压使得视网膜血供恢复，建立实验性急性高眼压视网膜缺血再灌注损伤模型。前房灌注后兔眼瞳孔散大，直接眼底镜检查可见视网膜中央动脉塌陷、血流完全阻断、视网膜苍白，为视网膜缺血成功的标志；拔出灌注针头，眼底镜观察可见视网膜血流恢复，为视网膜再灌注的标志。造模后每日4次氧氟沙星滴眼液滴眼预防感染，共3d。
1.3 动物分组及处理
设立正常对照组、模型组及EPO组，观察时间点分别为模型建立后第1、3、7、14天。对照组/模型组：24只兔，每只兔随机选取一眼为正常对照眼，另一眼则为模型眼。对照组兔眼不做任何处理，模型眼造成视网膜缺血再灌注损伤。于造模后第1、3、7、14天每个时间点各摘除6只兔双眼，进行HE染色，观察视网膜的形态结构、测量IRL厚度并计数RGC。
EPO组：24只兔，在造模前第3天及造模结束时，每只兔分别皮下注射100IU/kg的EPO(每只兔共接受2次注射)。其余处理与上述2组相同。每只兔任选一眼为观察眼，每个时间点摘除6只观察眼。
1.4 视网膜切片制作及HE染色
分别于再灌注后第1、3、7、14天经兔耳缘静脉注射空气10mL栓塞处死家兔，立即摘除眼球。取颞侧半眼壳(以视乳头为界)迅速置入改良的组织固定液中固定24h。然后梯度酒精脱水、二甲苯透明、60℃浸蜡、石蜡定向包埋。为保证取材部位相同，含视乳头一侧的切缘向下包埋。过视神经乳头做垂直子午线的连续3张视网膜切片，片厚5μm。蒸馏水中展开，烤片机烤片。
二甲苯切片脱蜡，经梯度酒精下行至水。切片过自来水后入苏木精液15min，自来水冲洗，盐酸乙醇分化。分化后水洗、氨水返蓝，以显微镜下见细胞核蓝染，细胞质和结缔组织无色为宜。伊红乙醇溶液染色1～3min，950mL/L乙醇分色。分色后的切片再经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，用中性树胶封片。
1.5 内层视网膜厚度测量以及视网膜神经节细胞计数
依参考文献[45]方法测定IRL厚度和线形细胞密度，定量评价视网膜缺血再灌注损伤造成的细胞丢失程度。IRL厚度指视网膜内界膜到外核层和外网状层交界处之间的距离，单位为μm。于双目高倍光学显微镜下(×400)，应用Motic医学图像分析系统测量HE切片距视盘两侧边缘约1.5mm处各一个视野的IRL厚度。每只眼的IRL平均厚度来自3张切片的6个数据。在视网膜切片上距视盘两侧边缘约1.5mm处计数100μm长度内RGC数作为线形细胞密度。
1.6 统计学分析
所有数据均输入计算机，用SPSS10.0软件包进行统计学分析。相同时间点对照组和模型组均数的比较均采用配对t检验，相同时间点对照组和EPO组、模型组和EPO组均数的比较采用成组t检验。
2 结 果
2.1 用药前后视网膜组织学变化
光镜下对照组兔视网膜结构完整，可见3层细胞核，从内向外依次为RGC层、内核层、外核层(图1A)。RGC层的细胞呈单层排列，细胞边界清晰，胞质丰富，均质淡染，胞核较大，染色质均匀，染色较淡，部分核仁明显。
模型组缺血再灌注后第1天神经纤维层和RGC层水肿明显，RGC体积变大、胞质染色变淡有空泡、细胞核也增大(图1B)。第3天仍可见到水肿改变，但有所减轻，开始出现RGC细胞核固缩、坏死(图1C)。第7天水肿消失，视网膜组织变薄，部分RGC消失(图1D)。第14天大部分RGC消失，RGC排列稀疏，视网膜组织进一步变薄(图1E)。
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