作者：陶远,王红,乔智 作者单位：山东大学齐鲁医院眼科， 济南 250012
【摘要】 目的 探讨长期应用毛果芸香碱对兔眼角膜内皮细胞有无影响及影响方式。方法 用2%的毛果芸香碱给兔滴眼1个月和3个月后，取下兔眼球迅速固定，分离角膜内皮组织，用蛋白印迹（Westernblot）法检测兔眼角膜内皮细胞中抗凋亡基因bcl2蛋白及凋亡基因bax蛋白的表达，流式细胞仪检测角膜内皮细胞的凋亡率，透射电镜下观察各组角膜内皮细胞的超微结构变化。结果 应用毛果芸香碱1个月及3个月后，均呈现兔眼角膜内皮细胞凋亡基因bax蛋白表达增多，抗凋亡基因bcl2蛋白表达减少，3个月组兔眼角膜内皮细胞凋亡率高于对照组（P＜0.05），透射电镜下观察可见，1个月及3个月组细胞内空泡形成，线粒体肿胀，内质网扩张，细胞核固缩，染色质固缩周边化等典型凋亡改变。结论 长期应用2%的毛果芸香碱可以诱导兔眼角膜内皮细胞发生凋亡。
【关键词】 细胞凋亡；角膜内皮；毛果芸香碱；bax蛋白；bcl2蛋白
Abstract: Objective To investigate the effects and mechanisms of pilocarpine on corneal endothelium in rabbits. Methods 20 rabbits in the experiment group were subjected to 2% pilocarpine 3 times a day for 1 month or 3 months. The expressions of bcl2 and bax protein were determined by Westernblot, the apoptosis rate of rabbit corneal endothelium cells was determined by flow cytometry, and the morphological changes of the corneal endothelium cells were determined by transmission electron microscopy. Results The expression of bax protein in the experimental group was higher than that in the control group, however the expression of bcl2 protein was lower than that in the control group. The apoptosis rate of the rabbit corneal endothelium cells using pilocarpine for 3 months was significantly higher than that of the control group (P＜0.05). Also transmission electronic microscopy revealed there were morphological characteristics of apoptosis including swelling of organelles, increasing of vacuoles in the cytoplasm, compaction and margination of nuclear chromatin in the groups after using pilocarpine for 1 month and 3 months. Conclusion Topical use of 2% pilocarpine can induce the apoptosis of corneal endothelium cells in rabbits.
Key words: Apoptosis; Corneal endothelium; Pilocarpine; bax protein; bcl2 protein
毛果芸香碱是一种在临床广泛应用的抗青光眼药物。但近年发现［1］，经药物保守治疗的慢性闭角型青光眼患者较同年龄正常人角膜内皮计数降低。除高眼压外，长期用毛果芸香碱有可能是造成上述陶远,等.毛果芸香碱滴眼对兔眼角膜内皮细胞凋亡作用的影响现象的原因之一。本研究通过采用2%的毛果芸香碱给兔滴眼一定时间，观察毛果芸香碱对兔眼角膜内皮细胞的影响及影响方式。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与试药
2～2.5?kg健康新西兰大白兔15只，雌雄不限，由山东大学医学院实验动物中心提供。药品：2%毛果芸香碱系沈阳市兴齐制药有限责任公司生产(批号20051118)。
1.1.2 试剂及仪器
F12/DMEM培养液系美国Gibco公司生产，鼠抗兔bcl2基因蛋白单克隆抗体、鼠抗兔bax基因蛋白单克隆抗体、内参βactin均为美国SantaCruz公司生产，HRP标记山羊抗小鼠IgG系深圳晶美生物工程有限公司生产，BD FACSCount流式细胞仪系美国BECTON DICKINSON公司生产，JEM1200EX透射电镜系日本电子公司生产。
1.2 方法
1.2.1 实验分组及药物处理
将实验用兔分为三组，每组10只眼。① A组：对照组，未用2%毛果芸香碱点眼；② B组：2%毛果芸香碱点眼1月组，每日3次;③ C组：2%毛果芸香碱点眼3月组，每日3次。
1.2.2 取材
将兔四肢固定，断脊髓处死，摘除眼球，分离角膜组织，每组随机选取3只角膜组织用于电镜观察。将其余剪下的角膜组织片内皮面向上，撕下带有内皮细胞的后弹力膜，将其2等分，分别用于蛋白印迹法（Westernblot）检测和流式细胞仪检测。
1.2.3 蛋白印迹法（Westernblot）
检测bax和bcl2 在4?℃ RIPA缓冲液中处理三组眼球剥离的角膜内皮组织，置于含有酶抑制剂的细胞溶解缓冲液(150?mmol/L NaCl、1NP40、0.5去氧胆酸及50?mmol/L Tris HCl，pH8.0)中，室温下30?min，15?000?r/min离心10?min，取上清液，检测蛋白浓度。将同一蛋白浓度的待测标本煮沸5?min，分别加入7%十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶，电泳45～60?min(电压90?Ｖ)。将带有蛋白带的凝胶转移至硝酸纤维膜，在200?Ｖ电压下转移1?h，将其置于5%无脂牛奶中1?h(去除非特异性染色)后取出，将硝酸纤维膜置于一抗(浓度1：400)及βactin(浓度1：1?000)溶液中，4?℃过夜，漂洗3次后加HRP标记的二抗（浓度1：1?500），再置室温2?h，漂洗3次，用放射自显影法检测bcl2、bax、βactin蛋白条带，Kodak X胶片摄影。Western blot方法显示的蛋白带密度直观进行比较后，用ECL增强检测系统检测强度并经电脑分析。
1.2.4 流式细胞仪检测角膜内皮细胞的凋亡率
将三组眼球剥离的角膜内皮组织在质量分数0.02% EDTA中，37?℃消化30?min，吸去EDTA，再加入质量分数0.2%Ⅰ型胶原酶于37?℃消化30?min。用10%胎牛血清F12/DMEM培养液清洗细胞，离心2次，800?r/min离心5?min，调细胞浓度为106/mL，用荧光素标记的连接素V/碘化丙啶(AnnexinVFITC/PI)染色，流式细胞仪检测，激发波长为488?nm,发射波长为630?nm。重复3次取均值。
1.2.5 电镜观察
将每组随机选取的角膜组织块切成1?mm×1?mm大小，25?g/L戊二醛溶液中固定，10?g/L锇酸固定，不同浓度酒精及丙酮脱水，浸透包埋、固化，超薄切片(50～60?nm)，枸橼酸铅染色，JEM1200EX透射电镜下观察、拍片。
1.3 统计学处理
所有实验数据以±s表示，采用方差分析和q检验。统计学处理使用SPSS10.0软件完成。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 bcl2蛋白和bax蛋白在兔角膜内皮细胞的表达
三组角膜内皮组织均检测到bcl2、bax蛋白(图1)，经ECL系统分析，三组bcl2、bax蛋白与内对照βactin比值的平均值见表1。由表1可见，C组bcl2蛋白表达明显低于A、B组（P＜0.05），B组明显低于A组（P＜0.05）。C组bax蛋白表达明显高于A、B组（P＜0.05），B组明显高于A组（P＜0.05）。
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