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2.2 流式细胞仪检测兔眼角膜内皮细胞凋亡的结果
见表1、图2。B组细胞凋亡率与A组相比，差异无统计学意义，C组细胞凋亡率与A组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.3 兔眼角膜内皮细胞透射电镜下检测结果
透射电镜下可见，B、C组的兔眼角膜内皮细胞凋亡数量增多，主要表现为：细胞内空泡形成，线粒体肿胀，扩张的内质网与细胞膜融合，部分细胞皱缩，细胞核固缩，染色质固缩周边化，形成新月形，马蹄形，镰刀状及柳叶形等改变；A组未见上述改变，见图3。
3 讨 论
毛果芸香碱主要用于原发性闭角型青光眼。原发性慢性闭角型青光眼在我国发病率较高，部分患者由于各种原因，选择了长期应用毛果芸香碱等药物进行保守治疗，另有部分术后残余青光眼的患者亦需长期滴用此药控制眼压。毛果芸香碱降眼压机理是：① 局部应用毛果芸香碱后直接兴奋虹膜括约肌，引起缩瞳，虹膜向中心拉紧，使周边虹膜离开房角前壁，开放房角，房水得以通过小梁网及Schlemm管畅通流出（用于闭角型青光眼）；② 通过收缩睫状肌的纵行纤维，牵引巩膜嵴，使小梁网间隙开大，房水引流阻力减小，增加房水排出，降低眼压（用于开角型青光眼）。
毛果芸香碱的副作用主要为强直性瞳孔缩小、亚临床虹膜炎、虹膜后粘连等。毛果芸香碱引起瞳孔括约肌、睫状肌持续收缩的机制主要是使细胞内的Ca2+水平升高。它可以通过兴奋M型胆碱受体，或通过IP3受体的激活动员内质网的Ca2+贮存库，引起内钙释放或通过胞外钙内流的方式而实现［2］。因此长期应用毛果芸香碱使瞳孔括约肌、睫状肌肌细胞内Ca2+长期处于高浓度状态的同时亦可能提高了角膜内皮细胞胞浆内的Ca2+浓度。另有研究发现［3］：毛果芸香碱可影响NaK泵，影响细胞的能量及Ca2+代谢，造成Ca2+在细胞内蓄积。
本研究结果表明，局部应用毛果芸香碱可导致角膜内皮细胞出现由bcl2/bax途径诱导的细胞凋亡。细胞凋亡是基因调制下细胞的主动死亡。细胞凋亡的发生有许多离子如Ca2+参与，Ca2+流入能激活细胞的凋亡。而bcl2具有防止细胞凋亡基因活化或阻断细胞凋亡基因产物的作用。bcl2抑制细胞凋亡的可能机制是［4］:抗氧化效应；阻止细胞内Ca2+的内流；调节Kras/raf介导的信号传递；阻止p53和cmyc在核内的定位，从而抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，减少该蛋白酶的底物多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶的降解。bcl2和bax是一对调控细胞凋亡的重要基因，正常时二者表达量平衡，如bcl2表达量降低或bax表达量升高则可促进细胞发生凋亡［5］。
本研究结果显示，B组、C组bcl2蛋白表达率较A组明显降低，bax蛋白表达率较A组明显升高，并随用药时间的延长，bcl2蛋白表达逐渐减少，bax蛋白表达逐渐增加。同时C组细胞凋亡率与A组相比有所升高。本实验选用的实验动物为健康新西兰大白兔，非青光眼动物模型，因而排除了高眼压对角膜内皮细胞的影响，减少了混杂因素，说明应用毛果芸香碱一段时间后，可使bcl2蛋白表达明显降低，bax蛋白表达明显升高，破坏二者表达量的平衡，促进细胞凋亡。
角膜内皮层的细胞密度及细胞功能正常对于维持角膜透明及其正常生理功能具有重要作用。人出生时角膜内皮细胞总数约为30万～50万个，平均密度约为4?000/mm2，随年龄的增加角膜内皮细胞的平均密度逐渐下降，至成人时降至1?400～2?500/mm2［6］。有学者认为［7］，角膜内皮细胞逐渐减少的机制是凋亡。Wilson等［8］应用反转录聚合酶链反应发现，原代培养的角膜内皮细胞有Fas、FasL、Bax、Bcl2、Bclxl、ICE等与凋亡相关的调节分子的mRNA的表达，在角膜中期保存过程中用电镜、TUNEL等方法均可发现内皮细胞的凋亡现象［9］。某些疾病、眼外伤和眼部手术可损伤角膜内皮细胞，加速内皮细胞的减少，当角膜内皮细胞的平均密度降至400～700/mm2以下时，可发生内皮泵功能失代偿，引起角膜水肿及大泡性角膜病变。此外局部应用2%多佐胺可加重既往已有的角膜内皮细胞损伤（如内眼手术、角膜移植、角膜内皮营养不良等），出现不可逆的角膜内皮失代偿［10］。本研究结果表明，长期应用2%的毛果芸香碱可以诱导兔眼角膜内皮细胞发生凋亡，在人眼是否有同样的作用尚无报道，也未见长期应用毛果芸香碱致人眼角膜内皮失代偿的报道。但经药物控制的慢性闭角型青光眼（无手术史）患者角膜内皮细胞密度明显低于同龄正常对照组，提示对青光眼患者，特别是某些角膜内皮细胞存在缺陷的患者，如虹膜角膜内皮综合征、曾有内眼手术史等，若需长期局部应用毛果芸香碱应注意检查角膜内皮细胞，以避免毛果芸香碱对角膜内皮细胞潜在的损伤。
【参考文献】
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