【摘要】 目的：探讨复方中药青光安混悬液对慢性高眼压兔筛板结构及功能的影响。方法：健康白兔30只，体质量2.5～3.0kg，雌雄不拘。每组6只12眼，分为5组，A为正常空白组、B为模型组、C为青光安组、D为噻吗心安组、E为青光安联合噻吗心安组，建立慢性高眼压模型前、后第1wk内3d测1次眼压，2，5wk各测1次眼压。5wk处死家兔取视乳头及周围组织然后修剪得筛板组织，用免疫组化方法测Ⅳ型胶原纤维平均吸光度值，并在光镜及电镜下观察组织结构的变化。结果：40眼成功造模后当时；1，2，5wk眼压均＞22mmHg。造模后5wk时各组眼压进行比较：青光安组眼压与模型组相比无明显差异（P>0.05），与其他治疗组及正常组相比有极显著差异（P<0.01）；噻吗心安组与联合组眼压相比无明显差异，并且两组与正常组眼压相比亦无明显差异。造模后5wk正常组Ⅳ型胶原纤维平均吸光度值与联合组相比无显著差异，与其他3组相比有极显著差异（P<0.01）；联合组与青光安组、噻吗心安组及模型组相比有极显著差异（P<0.01）。光镜、电镜结果表明，与模型组比较，治疗组巩膜筛板部纤维走向基本有序，无断裂、水肿，神经细胞胞质内线粒体大致正常，其中各组筛板结构病理改变程度由大到小依次为：噻吗心安组、青光安、联合治疗组。结论：青光安混悬液对慢性高眼压通过改善视网膜微循环起到筛板组织保护的作用,青光安联合噻吗心安明确降压后对筛板组织结构保护作用更为明显。
【关键词】 慢性高眼压；动物模型；青光安混悬液；Ⅳ型胶原纤维；筛板
Experimental study about the effect of qingguangan suspel on the structure and function of lamina cribrosa in rabbit eye with chronic hypertension
XiaoJing Li，QingHua Peng，ZhiCheng Zeng，JianChao Li
Foundation items: Scienctific Research Foundation of Key Project of Education Office of Hunan Province, China(No. 06A052); Scienctific Research Foundation of Project of Health Office of Hunan Province, China(No. 204084)
Key Discipline of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China; Boya Eye Hospital of Hunan, Changsha 410007, Hunan Province, China
Abstract
AIM: To investigate the effect of complex qingguangan suspel (QGAS) on the structure and function of lamina cribrosa in rabbit eyes with chronic hypertention.
METHODS: Thirty healthy rabbits were divided into 5 groups randomly and there were 6 rabbits(12 eyes) in every group. A is the normal controls and fed with normal sodium; B is the model group; C was treated with QGAS; D was treated with timolol meleate eye drops; E was treated with the two drugs. The chronic intraocular hypertension model was established physically. We measured intraocular pressure (IOP) 1 time before and after modeling and 2 times 1 week later and 1 time 2 weeks and 5 weeks later respectively. After 5 weeks we measured the quantity of collegan Ⅳ in lamina cribrosa with immunohistochemistry (IHC) and observd the structure of lamina cribrosa with light microscope and electron microscope.
RESULTS：There were 40 eyes with hypertension (IOP＞22mmHg) for over 1 week.The chronic intraocular hypertension model had established successfully. 5 weeks later in IOP there was no evident difference between B and C, but significant difference existed between B and the other treatment groups and A. There was no difference in D,E and A. Concerning average optical(AO) of collegan Ⅳ there was no difference in E and A, but the other three groups had significant difference with A extremely. The results of the light microscope and electron microscope indicated in comparison with B, fiber direction was in order basically and no fragmentation and edema existed and most of the mitochondria in nerve cells was normal in the treatment groups especially group E.
CONCLUSION：Qingguangan suspel can protect the structure of lamina cribrosa. QGAS’s effect of depressurization is feeble, so it may work through ameliorate retina microcirculation. Especially when both QGAS and timolol were given the treatment groups, the protective function is more manifest,but the mechanism is not very clear.
KEYWORDS：chronic hypertension; animal model; qingguangan suspel; collegan Ⅳ; lamina cribrosa
0引言
青光眼（glaucoma）是全球第2位可预防但不可逆的致盲性眼病，青光眼视神经损害的原发部位在相当于巩膜水平的结缔组织筛板，筛板本身同时伴有早期损害巩膜筛板部为巩膜最薄的地方，当眼内压增高时，此处结构容易发生变化，进而影响视神经细胞轴浆流，导致视神经损害。因而如果可以预防或逆转筛板结构改变，就能起到视神经保护的作用。然而，目前的研究尚未有确切的筛板保护作用的西药。青光安颗粒剂是集我院眼科多年临床经验结合现代制剂制备工艺研制而成，具有益气活血利水作用，运用于临床取得良好疗效的药物。我们观察了青光安混悬液对慢性高眼压性筛板结构组织的影响如下。
1材料和方法
1.1材料 健康白兔30只，体质量2.5～3.0kg，雌雄不拘。裂隙灯显微镜、眼底镜检查眼前节及眼底均无异常。的卡因眼液表面麻醉后，Schiotz眼压计连续测量眼压3d，1次/d，眼压＜17mmHg的动物方可使用，由湖南中医药大学动物实验中心提供。青光安混悬液（黄芪、生地、茯苓、车前仁、地龙等，按现代制剂制备工艺制成冲剂360mL,药物由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供，使用时稍使其温热后灌胃。Ⅳ型胶原纤维免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司提供。Schiotz眼压计（苏州医疗器械厂），Hitachi H600型透射电镜显微镜（日立公司）。
1.2方法 健康白兔，体质量2.5～3.0kg，随机分为5组，每组6只12眼。A为空白组，B为模型组，C为青光安组，D为噻吗心安组，E为青光安联合噻吗心安组。慢性高眼压动物模型的制作参照徐岩等[1]和王昌鹏等[2]的造模方法，并加以改进。的卡因眼液表面麻醉后，Schiotz眼压计连续测量眼压3d,1次/d，眼压＜17mmHg的动物方可使用。以250g/L乌拉坦1g/kg耳缘静脉注射行全身麻醉，的卡因眼液点双眼行表面麻醉，模型眼角膜缘用1mL注射器穿刺，形成一个小针孔穿刺并抽出房水约0.1mL，然后在此小针孔对侧的角膜缘换针管注入3g/L复方卡波姆溶液0.1mL，制作成慢性高眼压模型。造模后当时测量眼压1次，造模后1wk内每3d 1次，2wk时测眼压1次，维持眼压在22mmHg以上。对照眼仅作前房穿刺。如眼压回降到20mmHg，重复注射1次，可再次将升高的眼压维持1mo。眼压升高＞22mmHg，并能持续1wk为诱发慢性青光眼成功后开始给药，持续3wk。药物剂量按照人与动物体重等效剂量比率表计算，以成人临床常用剂量的3倍给药。A组（正常对照组）和B组（模型组）给予温开水10mL/kg；C组（青光安组）予青光安混悬液10mL/kg灌胃，均为2次/d；D组（噻吗心安组）予以点眼2次/d，7∶00，19∶00各1次；E组（青光安联合噻吗心安组）予青光安混悬液10mL/kg，并予以噻吗心安眼液点眼，各2次/d。造模后5wk取眼球，先用5g/L的卡因眼液表面麻醉后，3/8弧长4×12圆针和30缝线将鼻侧和颞侧结膜分别固定，并各留约4cm缝线端有助牵引取材。动物以空气栓塞法处死后，立即将眼球取出。在冰上用眼科剪沿角膜缘剪开眼球后，去除晶状体、玻璃体，各组每眼球取视乳头及周边1mm范围全层眼球壁。每组随机取2只眼球组织放入25g/L戊二醛溶液中固定，4℃冰箱保存以做电镜用；其余10眼球组织立即置于100g/L甲醛溶液中固定，4℃冰箱保存以做光镜用。将造模前及造模后当时、造模后1，2，5wk作眼压测量，并进行统计分析比较。将100g/L甲醛溶液固定的眼球视乳头标本做光镜送检，石蜡包埋，通过视乳头6∶00，12∶00方位做纵切，连续切片厚度为4μm，HE染色，光学显微镜下观察并显微摄像。另将眼球视乳头及周边1mm范围全层眼球壁标本经25g/L戊二醛溶液前固定后，0.1mol/L PBS漂洗，10g/L锇酸后固定，0.1mol/L PBS漂洗，丙酮逐级脱水，Epon 812环氧树脂包埋剂与1000mL/L丙酮1∶1比例浸泡＞2h，环氧树脂包埋剂浸泡2h包埋，瑞典LKB公司11800型修块机修块定位，瑞典LKB公司8800型超薄切片机切片，醋酸铀、硝酸铅双重染色，日立H600透射电镜观察筛板结构。再采用SABC法测定，将石蜡切片微波修复抗原染色处理：载玻片防脱片剂处理；切片常规脱蜡至水；灭火内源性酶；热修复抗原，抗原修复暴露抗原；陆续滴加正常山羊血清封闭液、一抗、生物素化山羊抗小鼠IgG；滴加试剂SABC，20℃～37℃ 20min；使用DAB显色试剂盒（AR 1022）；苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。显微镜观察，然后利用Imaging Pro Plus 4.5版本图像分析系统得出平均光密度。
统计学分析：采用SPSS 12.0统计软件，P＜0.05为差别有显著意义。计量资料进行正态检验和方差齐性检验，方差齐者两两比较用q检验，方差不齐采用秩和检验，数据用±s表示。
2结果
2.1兔眼变化 前房内注射药物后3～5d，出现睫状充血、角膜轻度水肿和轻度扩张及眼瞳孔扩大至椭圆形，对光反射消失32眼，前房渗出35眼；10～13d出现角膜轻中度水肿；15～20d角膜水肿转为轻度；20d后角膜水肿消失。
2.2眼压变化 造模前基础眼压为12.53±1.88mmHg，眼压＜17mmHg，符合动物选择标准；造模后1，2wk眼压均＞22mmHg,与兔基础眼压相比有极显著差异(P＜0.01)，但两者之间眼压无显著差异；按照造模后眼压＞22mmHg并维持1wk的原则，本实验慢性高眼压兔模型成功建立。造模后5wk联合组和噻吗心安组眼压虽仍高于正常组，但与正常组相比无显著差异，且两者之间相比亦无显著差异；青光安组眼压仍＞22mmHg，与正常组相比有显著差异(P＜0.01)，虽然低于模型组眼压值，但两者相比无显著差异。由此可知降低眼压主要是噻吗心安的作用，青光安降压作用弱。
表1 眼压和Ⅳ型胶原纤维比较（略）
2.3巩膜筛板病理学改变 光镜下可见：正常组神经细胞、纤维排列有序，无充血、水肿，无胶质细胞增生及炎细胞浸润等（图1A）。青光安组可见少量小胶质细胞增生，细胞间质局灶性水肿（图1B）。噻吗心安组可见局灶性细胞增生，纤维疏松、水肿，部分纤维断裂（图1C）。青光安联合噻吗心安组血管轻度扩张充血，纤维走向基本有序，无断裂、水肿（图1D）。模型组可见出血，纤维断裂、走向紊乱、水肿，出现波浪样变，胶质细胞增生，纤维组织增生、排列紊乱，细胞间质水肿（图1E）。电镜下可见：正常组神经细胞线粒体无嵴丢失、空泡变，内质网无扩张，细胞外间质无水肿，排列整齐，纤维无增粗、老化、密度增大等（图2A）。青光安组上方部分神经细胞核膜皱缩明显，胞质内质网丰富、扩张；纤维细胞周围见大量胶原纤维生成，部分轴索空泡变性（图2B）。噻吗心安组神经细胞内线粒体空泡变，内质网轻度扩张，局灶性细胞外间质水肿、稀疏、排列紊乱，核膜皱缩（图2C）。青光安联合噻吗心安组神经细胞胞质内线粒体大致正常（图2D）。模型组组织有水肿，神经细胞内线粒体嵴部分丢失或空泡变，部分内质网轻度扩张，神经纤维轴索有变性，结缔组织大量增生（局灶）（图2E）。
2.4Ⅳ型胶原纤维的含量 青光安组、噻吗心安组及模型组Ⅳ型胶原蛋白量高于正常组和联合组，且与正常组和联合组相比有极显著差异（P＜0.01）；联合组Ⅳ型胶原蛋白量虽高于正常组，但两者之间相比并无显著差异，说明在青光安组与噻吗心安联合使用时对筛板结构有保护作用（表1）。
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