【摘要】 目的：研究缺血性视神经病变以抑制视神经节细胞损伤。方法：Wister大鼠80只，分为正常组和缺血性视神经病变组。缺血性视神经病变组按缺血时间不同分为0.25，0.5，1，2，4，6，12h等7个组。采用RTPCR方法检测缺血诱导的大鼠视网膜内不同时间cfos基因的表达情况。结果：正常大鼠视网膜cfos mRNA有少量表达,缺血可诱导cfos mRNA的表达,缺血0.25h后cfos mRNA的表达水平即开始增加,在1h左右达到最高,然后逐渐减少,12h后恢复到正常水平。结论：急性视网膜缺血,cfos基因表达为快速一过性。
【关键词】 缺血性视神经病变；cfos；大鼠
Change of cfos gene during the apoptosis of retinal ganglion cells of ischemic optic neuropathy
Yao Guo, Lei Chen, LiMin Liu, MinFang Wang
Foundation item: Science and Technology Foundation of Shenyang City, Liaoning Province, China（No.1063237300）
Eye Disease Institute of Shenyang, Shenyang 110031, Liaoning Province, China; Ocular Fundus Disease Center, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Abstract
AIM: To prevent retinal ganglion cells (RGCs) from damage by studying the ischemic optic neuropathy (ION) models to conquer the blinding ophthalmocace.
METHODS: Eighty Wister rats were divided into 2 groups: the control and the ION group. The ION group included 7 subgroups according to time 0.25, 0.5, 1 hour, 2, 4, 6 and 12 hours. RTPCR method was used to determine the cfos gene expression of ischemicinduced RGCs at different times.
RESULTS: Small amount of cfos gene was detected in the control through RTPCR method and the ischemia can increase the expression of cfos mRNA at 0.25 hour and peaks at 1 hour and then gradually decreased to normal at 12 hours.
CONCLUSION: The cfos expression in the acute ION models is a fast and transient progress.
KEYWORDS: ischemic optic neuropathy; cfos; rat
0引言
最近的研究证实，脑缺血导致基因表达与调控的大范围改变。例如，缺血导致cfos和cjun家族即刻早期基因的迅速表达，这些家族的基因产物相互作用以形成fosjun异质二聚体，这种聚体发挥所谓的AP1转录因子的作用，调节其他基因的表达。局部缺血引起cfos和cjun mRNA(54,55)的即时表达,这种表达在早期再灌注时达到顶点，在AP1黏着运动中增加了4～6倍。
1材料和方法
1.1材料 选用体质量为200g的Wister大鼠80只，实验前均散瞳查眼底，无血管走行异常、血晕良好和无视神经萎缩，在国家一级动物实验室饲养。按缺血时间不同分为0.25，0.5，1，2，4，6，12h等7个组,每只鼠右眼为缺血眼,左眼做自身对照组,另设正常对照组。9600型PCR仪Metreo德国，凝胶电泳分析系统Fluorchem美国Alfha公司，细胞图像分析仪器MetaMoph/C5050/BX41日本，紫外分光光度仪，Dullbecco改良Eagle培养基Dullbecco‘s modified Eagel’ medium（DMEM），新生牛血清杭州四季青生物工程材料研究所，胰蛋白酶1∶250 Difco Gibco，Trico，Takara公司，RTPCR一步法试剂盒，大连宝生物公司，Βaction引物，大连宝生物公司合成。
1.2方法 缺血性视神经病变模型制作见文献[1]。取提取的各组RPE细胞总RNA 2μL，分别加入OligodT23VN引物（50μmol/L）2μL，dNTP混合物（2.5μmol/L）4μL，加入DEPE水，使反应的总体积为20μL，70℃加热5min，短暂离心后放置冰上，取16μL混合物，加入10×RT反应缓冲液2mL，RNAase抑制剂1μL，MMuLV逆转录酶1μL，使反应总体积为20μL。42℃孵育1h，75℃5min使酶失活，加入RNaseH 1μL，37℃作用20min降解RNA，95℃酶失活，逆转录成cDNA。然后以cDNA为模板，进行PCR扩增。
图1 RTRCR检查正常条件下及缺血条件下cfos mRNA的表达 M：正常条件下；0：对照组；1：激光后0.25h；2：激光后0.5h；3：激光后1h；4：激光后2h；5：激光后4h；6：激光后6h；7：激光后12h。（略）
PCR程序扩增cfos反应体系为：PCR Buffer(Mg2+) 2.5μL,dNTP混合物（2.5Mm）4μL,cDNA 1μL,上游引物5TTGTGAAGTGCAAATGTTCTAAAGG3 0.5μL,下游引物5CAAGAAATCTCCCGTGAAAT3 0.5μL,Taq DNA polyme（5U/μL）0.25μL,ddH2O至25μL,扩增βactin反应体系为：PCR Buffer（Mg2+）2.5μL，dNTP混合物（2.5Mm）4μL，cDNA 1μL，上游引物：5AAATCGTGCGTGACATTAA3 0.5μL，下游引物：5CTCGTCATACTCCTGCTTG3 0.5μL，Taq DNA polymerase（5U/μL）0.25μL，ddH2O至25μL。反应条件：95℃模板变性2min共进行35个循环：95℃模板变性30s，退火45s，72℃延伸1min；其中cfos退火温度为56℃，扩增片断长度为301bp；βactin退火温度为63℃，扩增片断长度为461bp。最后72℃延伸15min，4℃15min。每组取RTPCR产物5μL，20g/L琼脂糖凝胶电泳，与DNA分子质量标记比较并拍照。应用凝胶电泳分析系统软件对PCRβ产物作定量分析，重复3次。自动电泳凝胶成像分析系统下成像对PCRβ扩增产物、内参βactin目的条带进行灰度扫描分析，FluorChen V2.0系统采集扩增条带的整合吸光度值，读取相对积分吸光度（A）。
统计学分析：数据用±s表示，采用方差分析进行统计学检验，P<0.05有统计学差异。统计过程均用SPSS 11.5软件进行。
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