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图1 新西兰兔右眼组织工程人角膜内皮移植的透明状态 A：移植3d后；B：移植10d后；C：移植17d后；D：移植24d后；E：移植31d后；F：移植39d后。（略）
图2 新西兰兔移植39d后移植眼角膜内皮的观察 A：CMDil荧光；B：HE染色；C：茜素红染色；D：SEM。（略）
3讨论
TEHCE作为HCE的结构功能类似物，是角膜内皮盲患者通过临床角膜内皮移植而复明的希望[10,13]，而移植后能否维持角膜透明及其时间长短则是判定TEHCE是否具有HCE功能的主要指标[12,13]。本结果显示，TEHCE移植至新西兰兔后可使角膜维持透明长达39d，而国内外学者所重建的TEHCE在移植后使新西兰兔角膜维持透明的时间一般为1wk左右[5,6,10,11]。在哺乳动物中，兔的角膜内皮细胞比较特殊，其在体内外均具有增殖再生的能力[15]。因此，用新西兰兔作为角膜内皮移植模型，其最关键的问题就是要准确鉴别出移植后角膜内皮中细胞的来源，否则便无法判定角膜复明究竟是所植入TEHCE的作用还是新西兰兔固有角膜内皮细胞分裂所产生细胞移行的作用[16]。我们对CMDiI标记的检测结果显示，移植39d后新西兰兔角膜内皮移植区内的细胞均带有CMDiI标记，证明移植区内的细胞均来自TEHCE，而非来自新西兰兔残留角膜内皮细胞分裂所产生的细胞。该结论与在新西兰兔和裸鼠移植中所得出的结论是一致的[16]。哺乳动物角膜内皮作为一个完整的细胞单层，其所形成的屏障具有介导角膜内表面溶质和水运输的功能，在维持角膜透明和角膜厚度中具有必不可少的作用[17]。此外，角膜厚度也与内皮屏障和泵功能紧密关联，如果屏障和泵功能有一个或两个同时崩溃的话，就会导致角膜水肿，故细胞之间能否形成各种细胞连接进而形成紧密单层内皮，是判定TEHCE能否重建出内皮屏障和发挥泵功能的重要指标之一[17]。本结果还表明，TEHCE能维持移植兔角膜的正常厚度和组织结构，结合裂隙灯显微镜观察结果，说明所植入TEHCE具有形成内皮屏障和发挥泵功能的能力。该研究结论与对在体HCE细胞的研究结果是一致的。人角膜内皮细胞一般为扁平六角形，但也存在有一定比例的非六角形细胞。已有研究结果表明，角膜内皮细胞之间镶嵌性是按照一个特定阵列而不是随机排列形成的，角膜内皮细胞的形态及其镶嵌性也是维持角膜内皮层的形态结构及其功能的重要因素。因此，角膜内皮细胞是否具有六角形形态是判定其是否具有角膜内皮细胞固有正常属性的重要依据之一[2,3]。本结果还表明，所植入TEHCE种子细胞在移植兔角膜中多为六角形细胞形态，其间可形成细胞连接、重建出完整的镶嵌紧密的角膜内皮层，说明TEHCE能形成功能性角膜内皮屏障。该研究结论与对在体HCE细胞形态的研究结果是一致的。角膜内皮细胞及其所形成角膜内皮层的超微结构，是形成角膜内皮屏障和发挥正常泵功能的结构基础[3,17]。TEM观察结果表明，移植后TEHCE的种子细胞形成了连续的细胞单层，角膜组织和HCE细胞的结构正常，该研究结果与在体HCE及其细胞超微结构的研究结果是一致的。综合裂隙灯显微镜、茜素红染色、冰冻切片和SEM的观察结果可以看出，所植入TEHCE行使了正常角膜内皮的屏障和泵功能，可使移植角膜长期维持透明。综上所述，利用体外重建的TEHCE对撕除内皮层和DM新西兰兔进行穿透性角膜内皮移植后，移植眼角膜的组织结构正常， HCE细胞绝大多数为六角形且超微结构正常，形成了功能性角膜内皮屏障，可使兔角膜维持透明39d以上，有望作为角膜内皮的替代物用于角膜内皮盲的临床移植和治疗。
图3 新西兰兔角膜的超微结构（TEM） A：移植眼；B：对照眼；C：移植眼HCEC；D：对照眼RCEC。（略）
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