叶楠   侯光辉   吴静   徐锦堂   施文建   陈义   陈建苏   陈剑

珠海市人民医院   暨南大学医学院眼科研究室   519000

目的：研究人骨髓间充质干细胞重建角膜上皮的可能性。

方法：用密度梯度离心培养技术结合贴壁培养法分离纯化人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）并传代，将传代后的MSC接种于去上皮的兔角膜缘基质上培养诱导分化。免疫荧光检测角膜上皮细胞标志物CK12(Cytokeratin 12)的表达。运用体外和体内培养的方法使种植在基质片上的细胞复层化。待细胞融合形成单层后，置入插入式培养皿中进行气液界面培养。4周后进行HE染色及免疫组织化学检测，光镜下观察其复层情况。体内复层的过程中，应用浅板层角膜移植的方法。自动板层角膜刀做直径8.5mm，厚度160μm的新鲜猪角膜基质片，将MSC种植在基质片上，然后移植到去除角膜浅板层直径7.5mm，厚度160μm的新西兰大白兔的角膜基质表面。共做3兔3只眼，4周后处死动物，收集角膜，进行HE染色及免疫组织化学染色检测其复层情况。

结果：获得的间充质干细胞可以在体外培养扩增，表现出很强的增殖潜能。诱导3周后部分细胞表达角膜上皮细胞特征性CK12。运用气液界面培养法进行体外复层的结果显示细胞仍为单层。体内培养结果显示，移植4周后细胞可以复层化，与正常角膜上皮较为相似。共做3兔3只眼，2只眼角膜植片保持透明4周，1只眼保持透明1周。

结论：在本实验的诱导条件下，骨髓间充质干细胞可以分化为角膜上皮样细胞，体内培养可以使其复层化，MSC有可能作为组织工程技术角膜上皮重建的种子细胞的选择。