马进 张倩茹 朱铁培 章征 叶盼盼

　　浙江大学附属第二医院眼科中心 310009

　　目的：探讨合理的人眼玻璃体细胞分离及培养方法，对不同方法进行比较研究。

　　方法：取新鲜供体人眼球(死后3小时内)，无菌条件下用显微手术器械仔细分离，剥离出完整后段玻璃体，将其切成数段，方法一：经胶原酶(1mg/ml)—透明质酸酶(300u/ml)—胰酶(2.5mg/ml)于37℃联合消化1.5小时后，1000转/分离心5分钟，得到细胞沉淀;方法二：直接运用组织块培养法，将切成数段的玻璃体贴于Ⅰ型胶原包被的培养皿中。均采用含有20%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养液进行培养。当细胞生长至80%融合时传代培养，对第2~3代细胞进行免疫细胞化学鉴定。

　　结果：37℃、5%CO2培养箱中孵育1周后，可见有细胞贴壁生长或自组织块中爬出，且经过酶消法得到的细胞数量较组织块培养法明显为多。细胞形态呈多形性，部分细胞扁平宽大，可见多个伪足样突出。免疫细胞化学鉴定，此原代细胞可稳定表达S-100蛋白，而胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)和细胞角蛋白表达阴性，证实为玻璃体细胞。

　　结论：本次研究成功获得人玻璃体细胞，并得到以下几点体会(1)取材要仔细，尤其玻璃体皮质与视网膜内界膜连接紧密处，尽量完整分离到玻璃体皮质。(2)联合消化法较组织块培养法可培养得到较多玻璃体细胞。(3)培养所得的原代细胞生长较慢，约经3~4周长至融合，其后1~2周传代1次。