【摘要】 糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病微血管病变在眼部的表现，是<75岁成年人的首要致盲眼病。定期随访检查糖尿病患者的眼底及控制血糖、血压、血脂都有助于降低因视网膜病变而致失明的发生率，但其机制仍不明确。蛋白质组学及其相关技术的发展为蛋白质水平上研究DR的病理生理机制提供了强有力手段，该技术可以一次性研究大量蛋白质。比较蛋白质组学研究结果表明DR并不是由单一蛋白质启动的疾病，而是多种蛋白质共同参与的病理过程。目前，绝大多数鉴定出的差异性蛋白质其功能都不太明确，而且各蛋白质之间存在着复杂的网络调节关系。我们就其在DR蛋白质组学方面的研究进展作一综述。
【关键词】 糖尿病性视网膜病变;蛋白质组学;双向电泳;质谱分析
Recent progress of proteomics in diabetic retinopathy
GuoHai Chen, QinXiang Zheng, WenSheng Li
Foundation item: Science Research Foundation of Zhejiang Province, China (No.Y207824)
Eye Hospital, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325027, Zhejiang Province, China
AbstractDiabetic retinopathy(DR)is a diabetic microvascular disease affecting the eyes, which is a leading cause of blindness in adults under 75 years old. In recent years, regular screening for DR, blood glucose, blood pressure and blood lipid has contributed to lower incidence of blindness due to retinopathy. But still the pathogenesis of DR is unclear. At present, proteomics and related technologies provide a powerful tool to study the intrinsic pathophysiological mechanisms of DR at the molecular level. This technology can study an abundance of proteins at a time and identify the different expressed proteins. Comparative proteomics show that the DR is not activated by a single protein, but by a variety of proteins. At present, the functions of the identified proteins are not very clear, and there is a complex network between the various proteins. This article briefly reviews the recent progress of proteomics in DR.
KEYWORDS: diabetic retinopathy; proteomics; twodimension gel electrophoresis; mass spectrometry
0引言
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一组以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢疾病群，分为两种类型：1型糖尿病(胰岛素依赖型)和2型糖尿病(非胰岛素依赖型)。全球目前大约有1.8亿的DM患者，到2025年估计将高达3亿人，有70%～90%为2型糖尿病患者[1]。1997年我国DM患病率为2.51%[2]。糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病微血管病变在眼部的表现，视网膜病变是糖尿病眼病中最严重的并发症[3]。DR是50岁以上患者重要的致盲原因[2]，在西方国家则是<75岁成年人的首要致盲眼病[1]。几乎所有的1型糖尿病患者都会并发DR，特别是诊断为DM后10～15a期间，60%以上的2型糖尿病会并发DR[1]。在我国糖尿病患者中，DR患病率达44%～51.3%[2]。蛋白质组学(proteomics)就是从整体的角度分析动态变化的蛋白质组成、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用和联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律[4]。该学说开辟了研究蛋白质功能和细胞生命活动规律的新领域，主要内容包括组成蛋白质组研究、比较蛋白质组研究、蛋白质组学相关技术平台及生物信息学研究[5]。蛋白质组研究的技术主要有：双向凝胶电泳(twodimension gel electrophoresis，2DE)、生物质谱技术(mass spectrometry，MS)、蛋白质芯片和生物信息学技术[6]。虽然控制血糖、血压、血脂可以改善DR的病情，但其机制仍不明确，所以有待分子水平的研究来阐明DR的病理生理机制，以期获得更为有效的临床治疗手段。目前，蛋白质组学及其相关技术的发展为蛋白质水平上研究DR的病理生理机制提供了广阔的平台。用比较蛋白质组学对疾病和控制对照组进行研究，可以快速阐明疾病的病理生理机制，如疾病的发生、发展或消退减缓的内在分子机制，为临床诊疗提供新的视角和手段。虽然蛋白质组学发展才短短十几年时间，但关于DR的蛋白质组研究已取得令人瞩目的成果，现将DR蛋白质组研究的最新进展作一综述。
1蛋白质组学在DR动物模型中的应用
鼠类模型已经成为DM并发症研究的主要模型，鼠类DR模型与人类DR的自然病程有很多的类似，但依旧没有与人类DR病理生理机制完全一样的动物模型，不过这类模型为DR的基础研究提供了丰富的组织来源[7]。实验多选用200g左右的SD大鼠或Wistar大鼠，腹腔内注射四氧嘧啶200mg/kg或链脲霉素35～65mg/kg来制造DM模型，5d后测血糖，>16.7mmol/L为造模成功。
1.1 DR早期蛋白质组的变化
早期DM鼠神经视网膜组织的研究可以发现DR早期的病理生理改变，对于预防及干预DR都有很大的现实意义。2007年刘尚清等[8,9]在早期DM鼠视网膜上检测出36个蛋白有显著差异(P<0.05)，5个上调，23个下调，8个消失。该实验反映出2mo病程的DM大鼠视网膜已有蛋白质表达的差异，但未作MS鉴定，不知道是哪些蛋白质发生了变化。2007年Quin等[10]的研究结果显示在早期DM大鼠视网膜上有8个蛋白上调，27个下调。经MS鉴定，热休克蛋白70的两个亚型(Hsp70.1，AHsp70.8)和血小板活化因子α2只出现在DM组;β钙黏蛋白、光导蛋白及醛还原酶在DM组高表达，而琥珀酰辅酶A连接酶和二氢嘧啶酶相关蛋白2低表达。热休克蛋白的出现证实了炎症诱发DR的病理机制;血小板活化因子与缺氧性新生血管形成有关;β钙黏蛋白是视网膜毛细血管内皮细胞之间的连接物，其高表达可能与视网膜毛细血管渗漏引发的代偿机制有关;光导蛋白高表达可能与光传导功能障碍有关;琥珀酰辅酶A连接酶与能量合成有关;二氢嘧啶酶相关蛋白2与神经连接有关，其低表达可致神经营养不良。
1.2晶状体蛋白的相关研究
晶状体蛋白增多可能与抗氧化应激及代谢压力的代偿机制有关，晶状体蛋白还可能是有效的凋亡抑制因子，这些都是DR重要的病理机制[11]。2007年Wang等[12]运用2DE技术对2型糖尿病SD大鼠神经视网膜作了比较蛋白质组研究，检测发现α晶状体蛋白在2型糖尿病SD大鼠神经视网膜上高表达，并经蛋白印迹技术验证。2009年Fort等[13]用差异凝胶电泳(difference in gel electrophoresis，DIGE)及MS技术鉴定出DM大鼠视网膜上各类型的晶状体蛋白均高表达，α晶状体蛋白家族(αA，αB)和βγ晶状体蛋白家族(βA2，βA4，βB3，γB，γD)均上调18倍。同Wang等的研究结果相似，但βγ晶状体蛋白家族的高表达则是第一次被检测出来，并经蛋白印迹技术及实时定量RTPCR验证。蛋白印迹结果及实时定量RTPCR结果显示：α晶状体蛋白、β晶状体蛋白和γ晶状体蛋白表达上调的时间点及其持续时间都不一样。这些结果提示各类晶状体蛋白在视网膜上定位不同，因此该实验小组用免疫荧光技术对各类晶状体蛋白进行了定位。α晶状体蛋白定位在光感受器外节、外丛状层、神经节细胞/神经纤维层上，在DM鼠视网膜神经节细胞/神经纤维层及激活的Müller细胞上高表达;β晶状体蛋白定位在神经节细胞内丛状层和感光细胞上，可能是由双极细胞、无长突细胞或水平细胞分泌，在DM鼠视网膜内丛状层高表达;γ晶状体蛋白定位在神经节细胞/神经纤维层、内丛状层及光感受器上，在DM鼠视网膜神经节细胞层高表达。
1.3干预后蛋白质组的变化
经干预后，某些上调或下调的蛋白质可以恢复到正常水平，这些蛋白质可能与该药物发挥效用有关。2008年Li等[14]运用DIGE及MS技术对葡萄籽原花青素提取物(grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE)治疗后的DM大鼠与非治疗组作了比较蛋白质组研究，结果显示有7个蛋白经过GSPE治疗后恢复到正常水平，分别是αB晶状体蛋白、βA4晶状体蛋白、αA晶状体蛋白、泛素羧基末端水解酶L1，G蛋白β1，lgG2A和丙酮酸激酶。αB晶状体蛋白和αA晶状体蛋白在DM鼠视网膜上高表达，经GSPE治疗后恢复到正常水平，说明αB晶状体蛋白和αA晶状体蛋白的高表达参与DR的病理生理机制，而GSPE对αB晶状体蛋白和αA晶状体蛋白表达的抑制作用可能有助于DR的恢复;泛素羧基末端水解酶L1在糖尿病鼠视网膜上低表达，它可能是细胞周期调控蛋白，与视网膜色素上皮细胞的变性增殖有关，经GSPE治疗后恢复到正常水平，从而可以看出GSPE有助于改善DR的病情。2009年Fort等[14]的研究结果显示全身使用胰岛素治疗后可恢复上调的α晶状体蛋白和γ晶状体蛋白，但对β晶状体蛋白没有影响;在处死DM鼠的前4d结膜下注射低剂量的胰岛素，此方法并不影响血糖水平，但仍能恢复8wk时上调的α晶状体蛋白和γ晶状体蛋白，说明全身或局部使用胰岛素皆能恢复上调的α晶状体蛋白和γ晶状体蛋白。全身或局部使用胰岛素可以恢复α晶状体蛋白和γ晶状体蛋白，可能与视网膜上的胰岛素受体/磷酸肌醇激酶3途径有关。
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