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2蛋白质组学在DR患者中的应用
DR患者的蛋白质组研究多以玻璃体液作为研究材料，因为玻璃体与视网膜关系密切，眼底的病变必然会导致玻璃体液的蛋白组成及其量的改变，而且取材也比较方便，通过检测玻璃体液中的差异性蛋白有助于了解DR的分子病理机制。
2.1 DM患者(NDR)与NDM患者玻璃体液中的差异性蛋白质
研究DM患者(NDR)与NDM患者玻璃体液中的差异性蛋白可以发现DR的促发因子，明确DR的促发机制可以有效地预防DM患者的眼部并发症。2008年Gao等[15]运用2DE及液相色谱串联质谱(LCMS/MS)技术对6个NDM、4个DM患者(NDR)和7个增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者的玻璃体液作了比较蛋白质组研究。结果显示载脂蛋白AIV、补体C4b和补体因子B在DM患者中比NDM患者高(P>0.05)，而碳酸酐酶只在DM患者中表达。碳酸酐酶1和碳酸酐酶2的增高可能是由PDR患者玻璃体液中红细胞裂解导致的，这说明玻璃体出血、红细胞溶解及红细胞胞内物质的释放(包括铁、血红素和碳酸酐酶等)可能是PDR的促发机制。该实验小组对NDR与PDR玻璃体液也作了比较，其中血管紧张素原在PDR玻璃体液中表达升高，而钙同线蛋白、感受器间视黄醛结合蛋白和神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂表达降低。
2.2 PDR与MH患者玻璃体液中的差异性蛋白
黄斑裂孔(macular holes，MH)患者常作为PDR研究的控制对照组，可能是因为MH患者对玻璃体液中的蛋白质成分改变不大，而且比取正常人眼的玻璃体液更符合伦理。研究PDR与MH患者玻璃体液中的差异性蛋白质可以从多方位了解PDR的病理生理机制。2006年kim等[16]应用2DE及MS技术鉴定了15个PDR和10个MH患者玻璃体液中的差异性蛋白质。检测出8个蛋白点有显著差异，5个上调(色素上皮细胞衍生因子、丝氨酸蛋白酶抑制剂、前列腺素H2D异构酶、α2HS糖蛋白和锚蛋白重复域15)和3个下调(α1抗胰蛋白酶前体、βV血影蛋白和载脂蛋白AIV前体)。色素上皮细胞衍生因子有控制新生血管形成的作用;丝氨酸蛋白酶抑制剂可能在血液凝固、补体激活和细胞凋亡中发挥调控作用;前列腺素H2D异构酶具有抗增殖功能及抑制纤维血管增殖的作用;βV血影蛋白与感光细胞外节相联接，可能参与破坏光感受器和视网膜色素上皮细胞，与感光细胞新陈代谢有关;载脂蛋白AIV前体参与胆固醇逆向转运，其表达降低与PDR患者脂质沉积有关。鉴于玻璃体液中的高丰度蛋白质(白蛋白、转铁蛋白和α1抗胰蛋白酶等)使得低丰度蛋白质的检测困难，该实验小组进一步运用2DE、液相色谱基质辅助激光解吸电离串联质谱(LCMALDIMS/MS)和液相色谱电喷雾电离串联质谱(LCESIMS/MS)技术对19只PDR眼和11只MH眼的玻璃体液中的微量蛋白质进行了检测[17]。共检测到531个蛋白点，其中有240个蛋白点是第一次在玻璃体液中被检测到。鉴定结果显示胰岛素样生长因子结合蛋白2和胰岛素样生长因子结合蛋白5只在PDR玻璃体液中表达;碳酸酐酶1、碳酸酐酶2、血管生成素、骨桥蛋白、血管紧张素原和聚集素在PDR玻璃体液中表达增高。胰岛素样生长因子结合蛋白有防止血管氧化损伤和促进血管再生的功能，其与PDR的关系有待进一步研究;肝细胞生长因子激活前体与视网膜新生血管形成及增加血管通透性有关;碳酸酐酶1和碳酸酐酶2有增加视网膜血管通透性的作用，可通过激活激肽释放酶原而引起视网膜水肿;骨桥蛋白具有广泛的生理功能，如细胞黏附、免疫调节和血管生成等，其高表达可能与DR的病理机制有关;肾素血管紧张素系统(reninangiotensin system，RAS)存在于眼部[18]，PDR患者可能激活眼部RAS，并且血管紧张素II有增强血流动力和促进增殖的功能，可促进新生血管形成。血管紧张素原在PDR患者玻璃体液中高表达说明RAS与DR的病理机制有关。
2007年GarciaRameriez等[19]应用DIGE技术鉴定了8个PDR患者与10个MH患者玻璃体液中的差异性蛋白。检测出41个蛋白有显著差异(P<0.05)，28个上调，13个下调。共鉴定出11种蛋白，包括8个上调蛋白(锌α2糖蛋白、载脂蛋白AI、载脂蛋白H、纤维蛋白原A、补体C3，C4b，C9和补体因子B)和3个下调蛋白(色素上皮衍生因子、间质性视黄醇结合蛋白和间α胰蛋白酶抑制剂重链)，并用蛋白印迹和实时定量RTPCR技术验证了锌α2糖蛋白、补体C3、补体因子B、色素上皮衍生因子和间质性视黄醇结合蛋白。色素上皮衍生因子表达下调与kim等的结果正好相反，因kim等未用蛋白印迹技术加以证实，所以GarciaRameriez等[19]的实验结果更为可靠。锌α2糖蛋白可以抑制细胞增殖，可能是PDR增殖反应的抑制因子;补体系统的参与验证了PDR的炎症病理机制，激活补体系统可引发血栓形成、白细胞停滞和细胞凋亡，这些都参与了DR新生血管形成;色素上皮衍生因子可能是参与光凝治疗DR减少视网膜新生血管形成的作用因子，因此可以作为疗效评价指标;间质性视黄醇结合蛋白与视色素再生有关，其量的减少可致视力下降。该实验小组又进一步运用蛋白印迹及实时定量RTPCR技术对载脂蛋白AI和载脂蛋白H进行了深入研究[20]。结果显示载脂蛋白AI和载脂蛋白H皆在DM患者中表达高。载脂蛋白AI是强有力的活性氧清除物，可能有保护视网膜免受氧化损伤的作用;载脂蛋白H可能有清除凋亡细胞和防止细胞凋亡的功能，而细胞凋亡正是DR发病机制的一个早期事件，但仍需要更多的研究来支持这个假说。
2.3 DME与NDME患者玻璃体液中的差异性蛋白
糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema，DME)患者表现为后极部有明显的视网膜增厚或硬性渗出，是引起DM患者失明的主要原因之一，其发生主要与病程长、高血压、使用胰岛素、高糖化血红蛋白和蛋白尿有关[21]。研究DME与NDME患者玻璃体液中的差异性蛋白有助于预防和治疗DME，降低致盲率。2005年Ouchi等[22]应用2DE及LCMS/MS对DME患者的玻璃体液作了蛋白质组研究。4个NPDR未并发DME患者(NDEM组)的4眼和14个NPDR并发DME患者(DEM组)的16眼玻璃体液经2DE及LCMS/MS分析，共检测到200个蛋白点。有6个蛋白(色素上皮细胞衍生因子、载脂蛋白AIV、载脂蛋白AI、甲状腺激素受体相互作用蛋白11、血浆视黄醇结合蛋白和维生素D结合蛋白)在DME组高表达，而有一个蛋白(载脂蛋白H)只在NDME组中表达。载脂蛋白AIV高表达可能与DME患者视网膜硬性渗出有关;甲状腺激素受体相互作用蛋白11与甲状腺激素受体和视黄醇类受体有相互作用，其具体功能不明;载脂蛋白AI在视网膜色素上皮细胞中发现，参与脂质运输;载脂蛋白H是血浆脂蛋白的组成部分，具有激活脂蛋白脂肪酶和刺激血浆清除脂质的功能。载脂蛋白AI的高表达和载脂蛋白H只在NDME患者玻璃体液中表达，可能与DME患者视网膜脂质沉积有关。
2.4 DR患者相关组织细胞的差异性蛋白质研究
不同于以往采用玻璃体液来检测DR与NDR患者间的差异性蛋白，Decanini等[23]提取视网膜色素上皮层组织作为研究材料。共鉴定出18个差异性蛋白质，有15个上调。鉴定出的蛋白质中有62%在以往的研究中报道过，但皆为非视网膜组织的蛋白质组研究。鉴定出的蛋白质中有29%参与各种代谢过程，包括糖酵解代谢途径(磷酸变位酶和γ烯醇化酶)、柠檬酸循环(二硫辛酰胺脱氢酶)、脂质代谢(胆固醇载体蛋白X)、酮代谢(琥珀酰辅酶A:3酮酸辅酶A转移酶1)、维甲酸代谢(细胞视黄醛结合蛋白)、膜动力蛋白(膜联蛋白A4和A7)和蛋白质运输(硒结合蛋白)。在该实验中未检测到与DR相关的生长因子，如血管内皮生长因子和色素上皮细胞衍生因子，可能是细胞外分泌后，视网膜色素上皮细胞内的生长因子不足以被检测到。鉴于DR患者血视网膜屏障的破坏，血清中抗视网膜蛋白自身抗体的出现及升高与DR的病理机制相关，Ahn等[24]收集了11个NDR、14个NPDR、11个PDR和 5个NDM患者的血清及正常人的视网膜组织。经2DE和ESIMS/MS分析，共鉴定出18种差异性蛋白。有4种蛋白(肌酸激酶B、醛缩酶C、磷酸激酶1和碳酸酐酶2)只存在NPDR和PDR患者血清中，而在NDR及正常对照组中没有。鉴于醛缩酶C只在脑部神经元中表达，其自身抗体的出现可能意味着DR患者的血视网膜屏障受到破坏，可以作为DR临床诊断标志物，所以该实验小组进一步用ELISA检测了10个NDM、20个NDR和40个DR患者(包括20个NPDR和20个PDR)血清中抗醛缩酶C自身抗体的浓度。结果显示：NDR患者血清中的抗醛缩酶C自身抗体浓度比NDM患者高(P=0.05);DR患者比NDR患者高(P=0.01);而NPDR患者和PDR患者相比没有统计学差异，说明抗醛缩酶C自身抗体浓度与DR严重程度无关。从而可以看出抗醛缩酶C自身抗体可以作为诊断DR的临床标记物。
3小结
运用蛋白质组学及其相关技术鉴定出多种差异性蛋白质反映了DR并不是由单一蛋白质启动的疾病，而是多种蛋白质共同参与的病理过程。如载脂蛋白A1和载脂蛋白A4在DME患者玻璃体液中高表达，而载脂蛋白H只在NDME患者玻璃体液中表达，反映出这些蛋白共同参与了DME患者视网膜脂质沉积的病理过程;α晶状体蛋白、β晶状体蛋白、γ晶状体蛋白和载脂蛋白H等都与DR的细胞凋亡病理机制有关;色素上皮衍生因子、β血小板活化因子、钙黏蛋白、肝细胞生长因子激活前体、碳酸酐酶和骨桥蛋白等共同参与了视网膜新生血管形成及血管通透性增加的病理过程等。目前，研究重点是发现早期诊断DR及评价其预后的蛋白标记物上，如抗醛缩酶C自身抗体可以作为诊断DR的临床标记物;色素上皮衍生因子可能是参与光凝治疗DR减少视网膜新生血管形成的作用因子，可以作为光凝治疗的评价指标等。对于鉴定出来的大部分蛋白质，其相关功能都不太明确，而且各蛋白质之间存在着复杂的网络调节关系，还不能清楚地从蛋白质水平阐明DR的病理生理机制，所以这些蛋白质的功能及其与DR病理生理机制的关系都有待进一步深入研究。
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