中华眼科杂志 1999年第1期第35卷 论 著
作者：牛膺筠 王红云 纪建中 林红 张爱华
单位：266003 山东省青岛大学医学院附属医院眼科
关键词：眼睑肿瘤;蛋白质P53;增殖细胞核抗原
【摘要】 目的 探讨P53基因突变与眼睑恶性肿瘤发生的关系。方法 采用链霉卵白素-生物素(labelled streptravidin biotin，LSAB)免疫组化方法检测102例眼睑恶性肿瘤组织P53蛋白及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表达情况。结果 在正常眼睑皮肤、睑板腺及轻度不典型增生眼睑上皮中，未见P53蛋白表达，而中、 重度不典型增生，原位癌，浸润癌中，P53蛋白阳性表达率逐渐增高，其 PCNA指数也有增加趋势。30/53例基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)、16/32例鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)、10/17例睑板腺癌中，P53蛋白阳性表达;同时，随着肿瘤组织分化程度的降低，P53蛋白阳性表达程度有逐渐增高的趋势。PCNA平均指数(PI)值在基底细胞癌、鳞状细胞癌，睑板腺癌中分别为38.1±31.1、38.3±30.1、42.6±32.0。在肿瘤的不同组织学分型上，PCNA平均指数随分化程度的降低有逐渐增高趋势，其差异有显著性(均P<0.05)。P53蛋白阳性表达的肿瘤组织，其PI值均高于P53蛋白阴性表达者，差异有显著性(均P<0.05)。结论 P53 基因突变在眼睑恶性肿瘤的发生中起着重要作用，是导致细胞增生异常活跃的因素之一，可能是判断肿瘤进展为恶性的标志。
A study on expressions of P53 protein and proliferating
cell nuclear antigen in malignant eyelid tumors
NIU Yingjun, WANG Hongyun, JI Jianzhong, et al.
Department of Ophthalmology, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266003
【Abstract】 Objective To observe the relationship between P53 gene mutation and malignant eyelid tumor.Methods The expressions of P53 protein and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in 102 cases with malignant eyelid tumors were examined by labelled streptravidin biotin (LSAB) immunohistochemical technique.Results Although overexpression of P53 protein was not detected in normal eyelid cutaneous epithelium, meibomian gland and mild epithelial dysplasia, the positive rate of P53 increased in degree in moderate and severe dysplasia, carcinoma in situ and invasive tumors, and PCNA labeling index (PI) progressively increased too. Overexpression of P53 protein was detected in 30/53 cases of basal cell carcinoma (BCC), 16/32 cases of squamous cell carcinoma (SCC), 10/17 cases of meibomian gland carcinoma, and the intensity of P53 protein immunostaining increased with the lowering in the degree of histological differentiation. The mean PCNA labeling index was 38.1±31.1, 38.3±30.1, 42.6±32.0 respectively in BCC, SCC and meibomian gland carcinoma. The PI value in tumor tissue with positive P53 protein expression was higher than that in tissues with its negative expression (P<0.05).Conclusions The gene mutation of P53 protein might play an important role in the pathogenesis of malignant eyelid tumors, it may be one of the factors that can lead to abnormal hyperactivity of cell proliferation and it possibly can be a malignant sign in the progression of a tumor.
【Key words】 Eyelid Neoplasms Protein P53 Proliferating cell nuclear antigen
自1979年Lane及Crawford用联合免疫沉淀法研究并发现P53蛋白以来， 国内外学者对其结构、功能进行了大量的观察，结果表明P53 基因是至今发现与人类恶性肿瘤相关性最高的一种抑癌基因[1]，其在肿瘤发生、 发展中的作用受到人们的普遍重视，但目前国内有关眼睑恶性肿瘤P53蛋白过表达的研究尚未见报道。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen ，PCNA)是一种核内蛋白，与细胞增殖有关。我们采用免疫组化方法观察了P53及PCNA在眼睑恶性肿瘤中的表达情况，初步探讨了P53蛋白过表达与肿瘤细胞增殖活性及恶性程度之间的关系，以期为临床病理诊断及预后评估提供依据。
资料和方法
一、资料
1.标本：取自原青岛医学院附属医院眼科1980年1月至1992年1月间送检的石蜡标本102例。其中基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)53例，鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)32例，睑板腺癌17例;男女各51例;年龄29～88岁。同时取部分正常眼睑皮肤及睑板腺组织者18例，轻、中、重度不典型眼睑上皮增生者依次为6、8、6例，原位癌4例，均经HE染色病理检查确诊。
2.试剂：链霉素亲生物素蛋白-过氧化酶免疫组化试剂盒(SP试剂盒)及鼠抗P53单克隆抗体(DO-1)，PCNA单克隆抗体(PC-10)，均为美国Zymed公司产品。
二、方法
1.免疫组化染色：载玻片以防脱片剂(3-amino propyltriethoxy silane，APES液)处理，4 μm厚石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化;3% H2O2室温下存放10分钟，灭活内源性过氧化物酶;微波炉处理标本10分钟(92℃～98℃),行抗原修复;正常羊血清(1∶20)20分钟，封闭非特异性抗原;加Ⅰ抗(抗P53单克隆抗体DO-1，1∶50;抗PCNA单克隆抗体PC-10，1∶50)，置湿盒内4℃孵育过夜，加生物素标记的Ⅱ抗(1∶100)，37℃下孵育30分钟;加辣根酶标记的链霉卵白素Ⅲ抗(1∶100)，37℃下孵育30分钟;以上各步骤完成后，均用PBS液(0.1 mol/L，pH 7.2)洗3次，以DAB酶显色5～10分钟，洒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。
2.对照：以PBS液代替Ⅰ抗作为阴性对照,已知皮肤鳞状细胞癌阳性标本作为阳性对照。
3.结果判断：P53染色以细胞核呈棕褐色为阳性细胞， 每张切片在高倍显微镜下(400倍)随机选择5个视野，计数每个视野中P53阳性细胞百分率，取其平均值，作为该例标本的P53阳性细胞百分率。P53蛋白表达结果按 De Rosa等[2]的标准：-为未见P53阳性细胞;+为P53阳性率<40%;++为P53阳性率40%～69%;+++为P53阳性率≥70%。PCNA染色是选择切片中最有代表性的视野，计算每例患者400个癌细胞中PCNA阳性细胞数， 同时计算增殖指数(PI)=(PCNA阳性细胞核数/400)×100%。
三、统计学处理
根据资料性质，统计学处理分别采用t检验、方差分析、χ2检验、 等级秩和检验。
结果
P53蛋白阳性显色为棕色，呈弥漫性或局灶性分布， 定位于肿瘤细胞核内(图1);胞质及肿瘤间质均呈阴性反应。有角化株的SCC，阳性细胞位于癌巢边缘分化较差的细胞中，而中央分化较好的癌细胞为阴性。BCC 组织内阳性细胞数较少，主要位于癌巢周围，染色相对较弱。PCNA阳性反应定位于细胞核内，呈棕色颗粒状。不同组织类型的肿瘤细胞其阳性显色密度及分布状态有差异，同一张切片的不同区域，其细胞阳性显色也不同，具有异质性。肿瘤邻近正常表皮的基底细胞层可见散在的阳性反应细胞，其它非肿瘤组织均未见阳性反应。
 图1 P53蛋白在睑板腺癌中的表达，P53蛋白阳性显色呈棕色，位于肿瘤细胞核内(箭头示) ×400
一、P53蛋白在肿瘤发生过程中的表达
在正常眼睑皮肤、睑板腺及轻度不典型眼睑上皮增生的病例中未见P53蛋白阳性表达，1例中度不典型眼睑上皮增生中见P53蛋白弱阳性表达，阳性细胞局限于异型增生的基底细胞层;重度不典型眼睑上皮增生中见1例P53蛋白阳性表达，阳性细胞散在分布于上皮基底层及棘层;原位癌全层均可见阳性细胞;浸润癌中P53蛋白阳性细胞数目多，染色强，呈弥漫分布。正常眼睑皮肤、睑板腺及轻度不典型眼睑上皮增生中，散在少许PCNA阳性细胞;随着病变的进展，在中、重度不典型眼睑上皮增生中，PCNA阳性细胞数逐渐增多，且出现于上皮中层，偶见表层，分布较规律。原位癌、浸润癌的PI值高于正常及癌旁不典型上皮增生，阳性细胞分布于上皮全层并向皮下组织浸润，细胞排列散乱(图2，表1)。
表1 SCC发生过程中P53蛋白及PCNA的表达
上皮组织例数P53蛋白PI值(
 ±s，%)
-++++++阳性率(%)
正常眼睑皮肤18180000.06.5±3.3
轻度不典型眼睑上皮增生660000.09.4±4.7
中度不典型眼睑上皮增生8710014.312.5±8.7
重度不典型眼睑上皮增生6501016.721.6±7.8
原位癌4201150.035.9±16.2
浸润癌321666450.038.3±30.1
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