【摘要】 目的 探讨白藜芦醇对高氧诱导的早产儿视网膜病变新生鼠视网膜B细胞白血病蛋白2(B-cell leukemia/lymphoma-2，bcl-2)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响。方法 选取鼠龄为7 d的Sprague-Dawley(SD)幼鼠60只，分A组(正常对照组)、B组(给氧组)和C(实验组1)、D(实验组2)、E(实验组3)三个实验组，每组12只。A组幼鼠生活在正常氧环境中，B组、C组、D组和E组幼鼠置于氧分压为(75±2)%的氧环境中连续生活5 d，建立高氧诱导的早产儿视网膜病变动物模型。C、D、E三个实验组分别予白藜芦醇10 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)、60 mg/(kg·d)灌胃给药，每天一次，连续5 d，所有幼鼠均于17 d鼠龄处死。应用Western-blot 免疫印迹法分析检测鼠视网膜bcl-2的表达，并以计算机图像分析仪进行分析;用ELISA方法检测鼠视网膜VEGF的表达。结果 与A组(正常对照组)比较，B组(给氧组)视网膜bcl-2和VEGF的表达是A组的4倍，两组差异有统计学意义(P<0.01);与B组比较，C、D、E三个实验组视网膜bcl-2和VEGF的表达逐渐减弱，呈剂量依赖关系，不同浓度的白藜芦醇实验组之间存在显著性的差异(P<0.01)，三种不同浓度(10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg)的白藜芦醇均显著抑制视网膜bcl-2和VEGF的表达，其抑制率分别为11.09%、38.05%、69.76%和3.42%、23.04%、43.69%。结论 白藜芦醇可显著抑制高氧诱导的早产儿视网膜病变新生鼠视网膜bcl-2和VEGF表达，可能对早产儿视网膜病变等视网膜新生血管疾病具有治疗作用。
【关键词】 白藜芦醇;早产儿视网膜病变;B细胞白血病蛋白2;血管内皮生长因子
Effect of resveratrol on the expression of bcl-2 and VEGF in oxygen-induced retinopathy of prematurity in rats
LI Wenlin， XIAO Shiyi， WANG Li， et al.
Department of Ophthalmology， Shenzhen Children’s Hospital， Shenzhen China， 518026
[Abstract] Objective To explore the inhibitory effect of resveratrol on the expression of bcl-2(B-cell leukemia/lymphoma-2) and VEGF(vascular endothelial growth factor) in an animal model of oxygen-induced retinopathy of prematurity. Methods Sixty 7-day-old Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups： group A (normal control group)， group B (oxygen-induced group) and three resveratrol-treated groups (group C， group D and group E). Each group consisted of 12 rats. The rats in group A lived in a normal oxygen environment; the rats in the other groups were placed in an environment with (75±2)% oxygen for 5 days to establish an animal model of oxygen-induced retinopathy of prematurity. The respective doses of resveratrol were given to the three resveratrol-treated groups (10 mg/kg， 30 mg/kg and 60 mg/kg) by gastric gavage once a day for 5 days. All rats were sacrificed on the seventeenth day. Western-blot analysis was performed to detect the effect of resveratrol on the expression of bcl-2 in the retinas， and the picture was analyzed with a computer image analysis meter. ELISA was performed to detect the expression of VEGF in the retinas. Results Compared to group A (normal control group)， the expression of bcl-2 and VEGF in the retinas in group B (oxygen-induced group) was strong with a 4-fold increase and the difference was statistically significant (P<0.01). Compared to group B (oxygen-induced group)， the expression of bcl-2 and VEGF in the retinas in the three resveratrol-treated groups gradually decreased， showing a dose-dependent effect. The effects of different concentrations of resveratrol at 10 mg/kg， 30 mg/kg and 60 mg/kg were statistically significant (P<0.01). The expression of bcl-2 decreased 11.09%， 38.05%， and 69.76% and the expression of VEGF decreased 3.42%， 23.04% and 43.69% in response to the respective doses of resveratrol. Conclusion Resveratrol can significantly inhibit the expression of bcl-2 and VEGF in an animal model of oxygen-induced retinopathy of prematurity， which may provide a new approach for the prevention and treatment of retinal neovascular diseases such as retinopathy of prematurity.
[Key words] resveratrol; retinopathy of prematurity; B-cell leukemia/lymphoma-2; vascular endothelial growth factor
随着新生儿医学的发展，早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)的发病率有显著增加的趋势。近年来尽管在诊断和治疗上有明显进步，但ROP已成为世界范围内重要致盲眼病之一[1-3]。为从根本上治愈ROP，减少ROP的发生，揭示ROP的发生机制、寻找早期防治ROP的有效药物已成为目前迫切需要解决的问题。氧诱导视网膜病变鼠模型是ROP和其他异常视网膜血管增生性疾病的主要模型之一。白藜芦醇是一类主要存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的多酚类化和物，目前已证明白藜芦醇具备抗血小板聚集、清除自由基、抗氧化、抗细胞凋亡、保护心血管等多种生物学作用[4-5]。本研究拟通过动物实验，观察白藜芦醇对氧诱导鼠视网膜B细胞白血病蛋白2(B-cell leukemia/lymphoma-2，bcl-2)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响，旨在探索白藜芦醇对ROP视网膜新生血管形成的影响作用及可能机制，从而为早期防治ROP开辟新的治疗途径。
1 材料和方法
1.1 主要仪器与试剂 电泳仪(BIO-RAD，USA)，微量高速制冷离心机(Beckman，USA)，超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，恒温水浴箱，电动摇床，台式多用恒温振荡器THZ-88-1型(江苏青太包鹿河化仪器)，紫外分光光度计(Beckman，USA)。Western blot试剂盒(晶美生物公司)和VEGF(晶美生物公司)，白藜芦醇(中国药品生物制品检定所提供的标准品，纯度大于99%)。
1.2 动物模型制备及分组 研究采用新生Sprague-Dawley(SD) 鼠60只，分A组(正常对照组)、B组(给氧组)和C(实验组1)、D(实验组2)、E(实验组3)三个实验组，每组12只。A组(正常对照组)幼鼠生活在正常氧环境中。将B、C、D、E组幼鼠于生后7 d与同笼的2只母鼠一起装入有机玻璃制作的密闭氧箱饲氧，一端设计为进气孔，另一端设计为出气孔，先将玻璃容器内气体抽出成为真空状态，然后接入100%湿润医用纯氧气，氧气流量控制在1.5 L/min，使容器内氧分压保持为(75±2)%，期间用氧浓度测氧仪监测容器内的氧分压，控制室温在(23±2)℃，日光照明，每两天打开玻璃容器更换垫料，加食、换水，替换母鼠。在此高氧环境中饲养5 d(即出生后第12天)，然后返回正常空气环境中饲养5 d(即出生第17天)，使幼鼠处于相对低氧状态下，建立ROP视网膜新生血管动物模型。其中B组出氧箱后不作任何处理;C、D、E三个实验组分别予白藜芦醇10 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)、60 mg/(kg·d)灌胃给药，每天一次，连续5 d，所有幼鼠均于第17天处死。
1.3 氧诱导鼠视网膜bcl-2检测(Western blot) 每组随机取4只鼠(8只眼球)，在显微镜下分离视网膜。将视网膜组织混合并置于5倍体积A 缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂cocktail。
在细胞裂解仪上裂解视网膜组织。将裂解液低温高速离心(4℃，12 000 r/min)15 min去除上清液，取2倍体积B缓冲液与沉淀物混合，4℃环境下作用30 min，低温高速离心(4℃，15 000 r/min)20 min。弃核碎片，以小牛血清白蛋白为标准，用紫外分光仪定量检测上清液的核蛋白含量。核蛋白液分装，于-70℃保存。将提取的核蛋白液，用Bradford法测定样本蛋白质浓度，制胶，在积存胶加样孔内加入等量蛋白质样本和标志物(marker)电泳，而后转移到硝酸纤维素膜上。用封闭液(5%脱脂奶粉、10 mmol/LTris、100 mmol/L氯化钠、0.1%Tween 20，pH值为7.5)37℃封闭1 h后再与1∶500鼠抗人bcl-2单克隆抗体4℃一起孵育过夜。充分洗涤后与二抗1∶500辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG室温下孵育1 h。DAB染色，拍照，再用凝胶图像分析系统分析，蛋白含量以面积×密度表示，以对照组测得值定为100计算相对光密度值。
1.4 氧诱导鼠视网膜VEGF检测(ELISA) 每组随机取4只鼠8只眼球，在显微镜下分离视网膜。将视网膜置400 ?滋L全蛋白裂解液中，并加入蛋白酶抑制剂，置细胞裂解仪上裂解视网膜组织。将裂解液低温高速离心(4℃，12 000 r/min)15 min去除沉淀物，以小牛血清白蛋白为标准，用紫外分光仪定量检测上清液的蛋白含量。上清液分装，于-20℃保存待用。上清液用双抗体夹心法(ELISA试剂盒)检测视网膜全蛋白液中VEGF的水平。操作按试剂盒说明书，每个标本行双复孔检测。
1.5 统计学分析 所有数据均用SPSS 15.0软件进行统计分析。数据以平均值±标准差(x±s)表示，进行t检验和方差分析(LSD法和q检验)。按如下公式计算不同浓度药物的抑制率，抑制率(%)=(1-实验组A均数/对照组A均数)×100%。
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