【摘要】 目的  检测视网膜母细胞瘤（RB）病人体细胞中RB1基因突变，探讨RB1基因突变的分子生物学机制。 方法  应用PCR-SSCP技术筛查RB病人白细胞基因组DNA，测序分析确定突变。 结果  在12例RB病人中，确定3例RB1基因生殖细胞性突变。他们分别是第10外显子中T至A杂合性突变，将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列;第10外显子1bp碱基缺失（GAT→AT），发生阅读框架改变;第22外显子中A至T杂合性突变，将精氨酸序列变为终止密码。 结论 这3例RB1基因生殖细胞性突变的方式为点突变和小缺失，这些突变改变了RB1基因的遗传信息，致使异常的RB1基因蛋白产生，导致视网膜母细胞瘤的发生。
    
　　Detection of heterozygous mutations of RB1gene in patients with retinoblastoma
     
　　Sheng Xunlun，Wu Weimin，Zhuang Wenjuan，et al.
   
　　Department of Ophthalmology，First People's Hospital of Qingdao Economic&Technical Development Zone，Qingdao266555.
   
　　【Abstract】 Objective To study RB1heterozygous mutations in patients with retinoblastoma.Methods Genom-ic DNA was used as a template for the PCR reaction to amplify all exons of RB1gene.These PCR products were screened by single strand conformation polymorphism（SSCP）and subjected to direct sequencing.Results Three germcell muta-tions in the RB1gene were identified in collected genomic DNA from RB patients:a T to A transition（TTC→TAC）at exon10，a deletion G（GAT→AT）at exon10，a A to T transition（AAG→ATG）at exon22.Conclusion Mutations in RB1gene are involving a few base pairs in this study.As a result of such mutation，the normal function of RB is usually disrupted，and retinoblastoma occurred.
   
　　Key words retinoblastoma gene mutation RB1
     
　　视网膜母细胞瘤（简称RB），是婴幼儿最多见的高度恶性、致死率高的眼内恶性肿瘤。由视网膜母细胞瘤基因（RB1基因）的两条等位基因同时失活所致，分遗传型（30%～40%）和非遗传型（60%～70%）两种方式。遗传型视网膜母细胞瘤病人体细胞都携带RB1基因生殖细胞性突变，85%～90%可能会发生双眼或单眼多灶型视网膜母细胞瘤，下一代子女中约有50%的机会遗传这一突变的基因，而其中的90%会患视网膜母细胞瘤 ［1，2］ 。因而，基于RB1基因生殖细胞性突变检测（遗传分型、产前与症状前基因诊断），目前是视网膜母细胞瘤的预防与早期诊断的有效途径。为了进一步了解RB病人RB1基因的突变特点，为临床遗传检查提供更多可靠的信息，笔者应用分子生物学技术对RB病人体细胞中RB1基因进行突变位点的检测，并结合以前的工作 ［3］ ，探讨了RB1基因突变的分子生物学机制。

　　1 资料与方法
    
　　1.1 一般资料 共收集散发RB病人12例，4例为双眼RB，其他8例为单眼RB，年龄1～5岁;同时收集了12例无亲属关系的健康人作为正常对照组。

　　1.2 方法
   
　　1.2.1 DNA提取 采外周静脉血10ml，应用DNA分离试剂盒（Promega公司产品）提取全血白细胞DNA。

　　1.2.2 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 应用美国PE公司2400型PCR仪。参照Toguchida［4］ 报道的方法进行PCR引物设计。PCR反应体系:10×Buffer2μl（含MgCl 2 10mmol/L），2×dNTP2μl（2mmol/L）引物2μl（10mmol/L），DNA模板1μl（1mmol/L），Taq plus I DNA聚合酶0.5μl（5 10 u/L），加双蒸水至100μl。95℃变性1min进入循环。95℃30s，退火30s，退火温度50℃～70℃（不同外显子，不同温度）。72℃延伸30s，共30个循环。最后72℃再延伸7min。PCR扩增产物的分析:取扩增产物5μl在1.5%琼脂糖凝胶电泳后进行EB染色，同时加Marker标记DNA相对分子质量。透射紫外线观察DNA电泳带，照相。
   
　　1.2.3 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）分析 将PCR产物置95℃下变性10min，加入10%非丙烯酰胺电泳槽孔中，50℃，2h，电压200～400V，银染、显带、干燥。
   
　　1.2.4 DNA测序 通过SSCP分析如发现有变异带出现，则将该PCR产物利用双脱氧末端终止法进行直接测序。
    
　　2 结果
    
　　通过PCR-SSCP分析，在12例病人中发现3例SSCP电泳有变异DNA单链带（图1～3）。其中2例经临床及病理检查确诊为双眼RB，1例为单眼RB。这3例病人均无家族史。PCR产物克隆测序分析显示:例1（3号）双眼RB病人10号外显子5'端至3'端第22bp处发生T→A置换，由TTC变为TAC，将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列（图1）;例2（7号）双眼RB病人10号外显子5'端至3'端第64bp处发生1bp碱基缺失（GAT→AT）（图2），发生阅读框架改变;例3（14号）22号外显子5'端至3'端第36bp处发生A→T置换，由AGA变为TGA，将精氨酸序列变为终止密码（图3）。

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