眼科 1999年第3期第8卷 短篇报道
作者：周 毅 刘宏伟
单位：北京市眼科研究所，100005
关键词：细胞学；结膜；角膜；兔
分类号 R770.4
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 硝酸纤维滤膜 购自天象人试剂公司。用打孔器制成直径6mm用于细胞滤膜培养，剪成2mm×2mm用于角膜、结膜细胞印迹，用蒸馏水浸泡以除静电，烤干后备用。
1.1.2 动物 新西兰大白兔购自中国药品生物制品检定所，体重为2～2.5千克。
1.1.3 营养液 胎牛血清购自金华市婺江犊牛血清研究所、MEM粉为Gibco产品。
1.1.4 试剂 按照常规方法配制10％福尔马林固定液、Schiff氏液、1％高碘酸溶液、0.5％伊红、0.5％铝苏木精及70％和90％的酒精。用蒸馏水配制10mg／ml的MTT液备用。
1.2 实验方法
1.2.1 滤膜毒性测定 将已制好的圆形滤膜放入含有Vero细胞的96孔板中，观察一周内的培养细胞形态，以不含滤膜的培养细胞为对照。
1.2.2 兔角膜和结膜上皮细胞印迹 将2mm×2mm的滤膜放于角膜、球结膜和睑结膜上，用磨平的一次性注射器内芯压10秒，印片直接放入10％福尔马林中固定，部分印片放入96孔板进行培养，在第2、4和7天取出后固定。
印片固定1小时后取出用水冲洗，采用PAS染色和H-E染色。
PAS染色：固定后的印片用70％酒精脱水5分钟，用水冲洗，1％过碘酸作用5分钟，用水冲洗，Schiff氏液作用5分钟，用水冲洗，用铝苏木精染色5分钟，用水冲洗，放入95％酒精中脱水2次，无水酒精脱水，放在载玻片上，加热干燥，加二甲苯透明，封片后镜下观察。
H-E染色：固定后的印片在铝苏木精中染色6分钟，用水冲洗，酸酒精中浸2次，用水冲洗，伊红中染色3分钟，取出后经70％、90％和100％的酒精脱水后，用二甲苯透明，封片后镜下观察。
2 结果
2.1 滤膜的毒性
在一周的观察中，含有滤膜的孔中的细胞生长良好，与无滤膜的细胞形态无区别。
2.2 角膜和结膜上皮细胞印迹
正常角膜细胞为多角形或圆形，体积较大，核∶浆为1∶2～1∶3，PAS染色无杯状细胞。
结膜细胞多为圆形，体积较小，核∶浆为1∶2，PAS染色有大量的杯状细胞，被染成粉红色，体积较大，核∶浆为1∶4～1∶5。
培养后第2、4和7天观察，发现角膜细胞和结膜细胞的形态与直接染色的细胞形态相似，细胞数有增加，并见有细胞分裂相。
3 讨论
硝酸纤维滤膜为惰性物质，它不与组织细胞发生反应，但它有粘附组织细胞的功能，因此可用它做细胞印迹和细胞培养。细胞印迹可研究机体表面细胞的情况，为诊断和治疗提供有效的参考。作为细胞培养的载体，可用于测定细胞中某些物质的改变。将印片或滤膜放入固定液中固定，放入染色液中染色，放在酒精中脱水，如用组织切片或细胞涂片染色必须将之贴附于载体，用载体进行染色没有用滤膜方便。
对于滤膜细胞的固定，我们曾经试用多种方法，Carnoy固定液、混合固定液和福尔马林缓冲固定液等对滤膜固定都较好，染色效果也较好。但Carnoy固定液时间较长可造成滤膜的溶解。滤膜本身为不透明物质，染色后需要将其透明，先将它进行脱水，如果条件控制好，在用100％酒精脱水过程中，就可使之透明，如透明效果不好，可再用二甲苯透明。对滤膜的脱水很重要，如脱水不足，透明效果不好，脱水时间过长，可造成滤膜的萎缩、干裂。
滤膜无毒性，用它做细胞培养的载体，但实验中发现，滤膜上细胞生长缓慢，但细胞形态没有变化，因此滤膜对细胞有一定的生长能力，可用于在体外研究影响细胞的物质。
应用印迹细胞学的方法，对外眼病的诊断有一定的参考价值。
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