【摘要】  目的 研究不同剂量姜黄素兔眼玻璃体内注射后的眼内毒副作用。方法 40只实验兔，随机分为4组，每组10只，一眼为实验眼，玻璃体内分别注射0.05 mg/0.1 ml、0.1 mg/0.1 ml、0.2 mg/0.1 ml姜黄素及0.5‰ 的DMSO 0.1 ml；对侧眼为对照眼，在玻璃体内注射0.1 ml生理盐水。注射后于第1、第3、第7、第14天进行常规眼部检查和视网膜电图检查；在第3、第7、第14天分别摘取2只眼球做光学和透射电子显微镜检查。结果 0.2 mg组在注药后第3天和第7天，实验眼暗适应视网膜电图a波振幅分别为（129±9）μV和（131±11）μV，与对照眼的（145±13）μV和（146±11）μV相比显著降低（P＜0.01）；实验眼b波振幅分别为（259±9）μV和（257±7）μV，与对照眼的（283±13）μV和（276±8）μV相比显著降低（P＜0.01）。第14天时a波和b波振幅又恢复正常。其余各组各时间段，实验眼a波和b波振幅与对照眼相比差异无统计学意义。各时间段常规眼部检查和视网膜组织学检查正常。结论 姜黄素玻璃体内注射0.2 mg以下剂量是安全可行的。

    【关键词】  姜黄素 视网膜电图 玻璃体内注射 增殖性玻璃体视网膜病变

    增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是指在视网膜前、后面及玻璃体内形成可以收缩的细胞性膜，进而引起视网膜牵拉、脱离与固定的一种病变，主要在裂孔源性视网膜脱离后形成或为外伤性、血管性、炎症性视网膜病变的结局，是一种常见的难治性致盲性眼病。姜黄素(curcumin)是从姜黄根茎中提取的一种酚类物质，具有突出的抗增殖、抗纤维化作用，另外还有抗肿瘤、  抗炎症、抗微生物、抗氧化及免疫调节等诸多药理作用[1]。PVR是眼损伤修复过程中眼内细胞过度增殖纤维化的结果，而姜黄素的药理活性可以在多方面满足PVR防治药物的条件（姜黄素可以诱导体外培养的视网膜上皮细胞细胞凋亡，抑制其增殖，已另文研究）。玻璃体内注射给药是防治PVR的首选给药方式，但局部用药的安全性必须引起足够的重视，本实验就针对姜黄素在玻璃体内注射后（姜黄素玻璃体内半衰期约为30 h，已另文研究）对视网膜的毒副作用进行研究。

    1  材料与方法

    1.1  实验用药  姜黄素，由美国ALEXIS公司提供，纯度≥98.5%，以少量二甲基亚砜（DMSO）助溶（DMSO终浓度≤1‰，对细胞无毒性作用[2]），用生理盐水配制成0.05 mg/0.1 ml、0.1 mg/0.1 ml、0.2 mg/0.1 ml三种剂量浓度，使DMSO终浓度为0.5‰，一次性滤器无菌过滤后用小瓶分装，置于-20℃避光保存备用。

    1.2  实验动物  河北医科大学第二医院实验动物室提供的健康成年新西兰白兔，雌雄不限，体重2.0~2.5 kg。应用前正常饲养，观察1周，并进行裂隙灯显微镜、间接眼底镜等常规眼科检查，筛选出40只正常兔为实验用兔。

    1.3  实验分组  24只实验用兔随机分为0.05 mg/0.1 ml组、0.1 mg/0.1 ml组、0.2 mg/0.1 ml组及DMSO组（生理盐水中含有终浓度为0.5‰的   DMSO）等4组，每组6只。随机选取每只兔的一眼为实验眼，在玻璃体内分别注射0.1 ml不同剂量的药物及DMSO；对侧眼为对照眼，在玻璃体内注射0.1 ml生理盐水（本组兔供电生理检查使用）。另16只兔随机分成上述4组，每组4只，双眼使用方法同上（本组供第3天和第7天时摘取眼球使用）。

    1.4  注药方法  复方托品酰胺滴眼液充分散瞳，以10%磺胺醋酰钠滴眼液冲洗结膜囊，0.5%盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后前房穿刺抽出0.1 ml房水，用一次性1 ml注射器于颞上象限角膜缘后4 mm处向玻璃体中央刺入，在直视下注入不同剂量的姜黄素或生理盐水，术后用妥布霉素地塞米松滴眼液点眼。

    1.5  电生理检查  在注药后第1、第3、第7、第14天分别做暗适应视网膜电图(electroretinogram，ERG)检查（仪器为德国罗兰公司生产的RETI port32型自动视觉电生理仪）。检查前用剃须刀刮尽额部及双侧耳缘部毛发，用75%医用酒精擦尽皮肤的油脂，以复方托品酰胺滴眼液充分散瞳，暗适应30 min，0.5%盐酸丙美卡因滴眼液角膜表面麻醉，参考电极和地电极（瑞典 Roland Consult公司）分别置于额部正中和同侧耳缘部，作用电极盘内注满生理盐水后安放在角膜上，角膜平面距白色闪烁刺激光30 cm，刺激强度为0 dB，闪光频率为0.1~0.5 Hz，检查3次，取平均值。主要记录暗适应a波和b波振幅的变化。

    1.6  组织学（光、电镜）检查  在注药后第3、第7、第14天（此时段摘取做完电生理检查后的兔眼）分别摘取对照和各剂量药物组眼球2只，做光学显微镜和透射电子显微镜检查。

    1.7  统计学方法  实验数据用（x±s）表示，使用SAS 8.1统计软件进行配对t检验。

    2  结果

    2.1  眼部常规检查结果  所有实验用兔的双眼在玻璃体内注药后各个时段，角膜、房水和晶状体均保持透明；玻璃体在注药后出现轻微混浊，1 d后恢复清亮，未见出血和炎症表现；视网膜未见异常。

    2.2  ERG检查结果  0.2 mg组在注药后第3天和第7天，实验眼a波和b波振幅降低，与对照眼相比差异有统计学意义（P＜0.01），第14天时a波和b波振幅又恢复正常。其余各组各时间段，实验眼a波和b波振幅与对照眼相比，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1、表2）。

    2.3  组织学检查结果  光学显微镜检查显示：对照组和各药物剂量组在各时间段视网膜组织结构均未见异常（见图1）。透射电子显微镜检查结果显示：对照组和各药物剂量组在各时间段视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）、光感受器内、外节和内核层的超微结构均未见异常（见图2~图5）。

    3  讨论

     姜黄素可以抑制诸如人胚眼细胞等多种细胞的增殖，对于防治PVR有重要的潜在价值，但是大多数研究仅限于对体外培养细胞的作用，或口服、静脉等全身用药[3-6]。对于PVR这类眼底增殖性疾病来说，由于血眼屏障的存在，即使全身大量用药也难以达到理想效果，而玻璃体腔内注药这种局部给药方式可以使药物直接作用于病变部位，即使微量也可产生高效，而且还可以避免全身用药的毒副作用。因此，研究姜黄素玻璃体腔内给药对视网膜的毒副作用对于扩展其给药方式和在眼科的临床应用有重要意义。

    玻璃体内给药后眼内毒副作用的评价方法主要包括视网膜功能学检查（视网膜电图，ERG）、视网膜组织学检查和常规眼部检查（包括裂隙灯显微镜和间接检眼镜检查）。

    ERG是光刺激视网膜时从角膜电极记录到的视网膜电反应的总和，能有效反映视网膜各层细胞的功能状态，是评价玻璃体内给药后视网膜功能状态的最主要指标。在ERG各项指标中，暗适应ERG的a波起源于视网膜外层的光感受器，b波起源于视网膜内层的双极细胞和Müller细胞，a波和b波的振幅变化是判断视网膜功能的灵敏、可靠的客观指标[7]。本研究发现，只有0.2 mg组在给药后第3、第7天，a波和b波振幅与对照组相比出现降低，而第14天时a波和b波振幅又恢复正常，其余各组均无显著变化。这说明0.2 mg剂量的姜黄素玻璃体内使用对视网膜内、外层功能的影响是相对轻微的，是可逆性、暂时性改变。

    无论是光镜检查还是超微结构检查，RPE细胞、光感受器内、外节和内核层结构均正常。药物在玻璃体内注射后的主要毒副作用是对RPE细胞的损害，这可能是由于视网膜内代谢旺盛的细胞主要位于光感受器内、外节和色素上皮的复合体[8]。对于药物毒性非常敏感的RPE细胞和光感受器内、外节均没有受到姜黄素的危害，因此可以认为，0.2 mg剂量的姜黄素玻璃体内使用对视网膜组织结构没有影响。

    所有实验兔的双眼在玻璃体内注射后各个时段，角膜、房水和晶状体均保持透明。虽然玻璃体在注药后出现轻微混浊，但我们认为这只是注药当时的短暂反应，1 d后即恢复清亮，未见出血和炎症表现。视网膜检查也未见异常。

    药物在眼内产生毒副作用造成的改变通常是由功能性改变到亚微观形态学改变，再到微观形态学改变，最后到肉眼可见的改变。研究结果显示，只有0.2 mg组在给药后第3、第7天，视网膜功能受到轻微的暂时性影响，14 d后又恢复正常，所有实验眼未出现从微观到肉眼可见的形态学改变。因此，无论是功能还是形态学检查均说明，0.2 mg以下剂量的姜黄素玻璃体内注射是安全可行的。

    综上所述，姜黄素玻璃体内注射治疗PVR这类眼底增殖性疾病是安全可行的，这不仅为我国中草药的开发利用提供了更加广阔的舞台，而且也为此类难治性眼病的治疗提供了新的思路。

【参考文献】
  [1] 许东晖，王胜，金晶，等. 姜黄素的药理作用研究进展[J]. 中草药，2005，36(11)：1737-1740.

[2] 戴旭峰，刘晓玲. 大鼠玻璃体内注射二甲基亚砜对视网膜电图的影响[J]. 眼视光学杂志，2007，9(1)：51-53.

[3] Moragoda L， Jaszewski R， Majumdar AP. Curcumin induced modulation of cellcycle and apoptosis in gastric and colon cancer cells[J]. Anticancer Res，2001，21(2A)：873-878.

[4] Han SS， Keum YS， Seo HJ， et al. Curcumin suppresses activation of NF-kappaB and AP-1 induced by phorbol ester in cultured human promyelocytic leukemia cells[J]. J Biochem Mol Biol，2002，35(3)：337-342.

[5] 龚凌，姜德咏，朱晓华，等. 姜黄素对培养的人胚胎视网膜色素上皮细胞增殖活性的影响[J]. 眼科学报，2004，20(4)：246-248.

[6] 胡艳红，祁明信，黄秀榕，等. 姜黄素对晶状体上皮细胞增殖的抑制作用[J]. 眼科研究，2006，24(2)：122-124.

[7] 吴乐正，吴德正. 临床视觉电生理[M]. 北京：科学技术出版社，1999：16-20.

[8] Jonathan H， Talamo AB， Donald JD. The influence of aminoglycoside antibiotics[J]. Am J Ophthalmol，1985，100(7)：840-847.