摘 要：目的：从分子水平探讨PRK术后前基质内Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达情况。方法：24只新西兰白兔，双眼行－5.0D近视治疗。于术后3天、1、2、3、4周取下角膜，用原位杂交方法观察Ⅰ型和Ⅲ型胶原的基因表达情况。结果：所有眼Ⅰ型胶原的mRNA表达均为阳性。术后2周时，Ⅲ型胶原mRNA表达阳性，到4周时表达较明显。讨论：PRK术后上皮下混浊与新生胶原的形成有关，且Ⅲ型胶原是新生胶原的主要成分。
Expression of type Ⅰ and type Ⅲ collagen mRNA in anterior stroma after PRK
QI Yan-hua（Department of Ophthalmology，The second Hospital of Harbin Medical University，Harbin150086）
Abstract：Objectsive：To study the expression of type Ⅰ and type Ⅲ collagen mRNA in anterior stroma after PRK．Method：24 new Zealand rabbits were operated for myopic ablation of 5.0 diopters．Corneas were studied for the genes expression of type Ⅰ and type Ⅲ collagen with in situ hibridization．Results：We observed the positive expression of type Ⅰ collagen mRNA at 2 weeks，and more evident at 4 weeks．Conclusion：The subepithelial haze was related with formation of new collagen，and type Ⅲ collagen is the major component．
Key words：laser surgery；cornea；collagen；RNA，messenger▲
准分子激光屈光性角膜切削术（photorefractive kertectomy，PRK），由于其切削组织精确、安全性好而成为目前临床治疗中低度近视眼的主要方法。PRK术后早期角膜的愈合过程主要包括上皮再生、上皮下胶原形成、成纤维细胞功能活跃等［1，2］。PRK术后角膜上皮下混浊的形成直接影响术后角膜的稳定性、透明性。为了进一步了解角膜基质内胶原纤维的变化，我们从分子水平探讨PRK术后早期角膜基质内Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达情况，为探讨PRK术后上皮下混浊的机制及治疗提供理论基础。
1 材料和方法
新西兰白兔24只，体重2～2.5Kg，经裂隙灯检查无眼部病变。
1.1 手术方法
4只兔（8只眼）作为正常对照组，其余20只兔（40只眼）经耳缘静脉注射2％戊巴比妥钠进行全身麻醉（每公斤体重1.5ml），并用1％地卡因滴眼进行表面麻醉。刮除7mm直径角膜上皮后，输入－5.0D的治疗程序进行切削治疗，切削深度为67μm，双眼均治疗，术毕双眼涂抗菌素眼药膏。使用的仪器是美国Chiron-Technolas keracor 116准分子激光治疗机。每个脉冲能量密度为120mJ／cm2，频率为10Hz，光学消融直径为7mm。
1.2 术后观察
术后每天用手持裂隙灯显微镜观察角膜上皮愈合情况，并排除角膜感染的可能。于术后3天、1、2、3、4周各取兔4只，经2％戊巴比妥钠全身麻醉后，摘除眼球，沿角巩膜缘剪下角膜，立即放入－197℃液氮中保存。
1.3 实验方法
①试剂：Ⅰ、Ⅲ型胶原cDNA质粒由美国学者何天源博士赠送。非放射性DNA标记及试剂盒为Boehringer mannheim公司产品，地高辛标记探针［9］。配预杂交液、缓冲液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。②步骤：冰冻切片厚度3～4μm，置于经DEPC水处理的载玻片上，室温干燥。4％多聚甲醛固定5分钟，PBS冲洗3次，室温下预杂交1小时。杂交液37°过夜。然后顺序以2×SSC、1×SSC、0.5×SSC各15分钟，室温摇床洗片。2％绵羊血清封闭30分钟。1∶5000地高辛抗体结合，室温下2小时。用缓冲液Ⅰ和Ⅲ洗片二次。以新鲜配制硝基蓝四氮唑（NBT）与5-溴4-氯3-吲哚磷酸盐显色液显色，室温下避光5～8小时，水冲洗，苏木精-伊红复染，封片。
2 结果
原位杂交结果显示，所有切片上Ⅰ型胶原的mRNA表达都很丰富，mRNA存在于上皮细胞间和成纤维细胞的胞浆中。术后3天和1周时，切片上Ⅲ型胶原的mRNA表达阴性，术后2周时，上皮下可见Ⅲ型胶原的mRNA阳性表达，术后4周时，前基质内Ⅲ型胶原的mRNA表达较丰富，见图1～3。
 图 1 正常对照组角膜Ⅲ型胶原mRNA表达阴性
 图 2 PRK术后2周，Ⅲ型胶原mRNA表达阳性
 图 3 PRK术后4周，Ⅲ型胶原mRNA表达阳性
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