中华眼科杂志 1999年第2期第35卷 白内障

作者：郝燕霞　何守志　谷志远　赵亚力　李星星　王常观　李琪　刘铁成

单位：100853 北京，中国人民解放军总医院眼科(郝燕霞、何守志、李星星、王常规、刘铁成)，分子生物学研究室(谷志远、赵亚力、李琪)

关键词：谷胱甘肽转移酶；基因；白内障

　　【摘要】　目的　探讨谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase, GST）基因缺失与老年性白内障形成的关系。方法　应用多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）方法对77例老年性白内障患者及76例健康对照者外周血细胞进行GSTM1基因检测, 并对其中的22例老年性白内障晶体上皮细胞进行GSTM1基因检测。结果　白内障组GSTM1基因缺乏率为53.25%, 对照组为46.05%, 两组间差异无显著性 (χ²=0.750, P＞0.05, OR=0.75)。20例老年性白内障晶体上皮细胞内GSTM1基因检测与外周血细胞检测结果一致(P＜0.01)。结论　GSTM1基因缺失与老年性白内障的发生缺乏显著关系。

　　Relationship between GSTM1 genotype and susceptibility to senile cataract　　HAO Yanxia, HE Shouzhi, GU Zhiyuan, et al. Department of Ophthalmology, General Hospital of the PLA, Beijing 100853

　　【Abstract】　Objective　To study the relationship between the glutathione s-transferase gene deletion and cataract formation.Methods　Blood cells of total of 77 cases with senile cataract and 76 controls were detected for GSTM1 gene, and the subcapsular epithelial cells of 22 cataract lenses were also detected for GSTM1 gene.Results　The GSTM1 gene deletion rate in cataract group was 53.25% and that in the control group was 46.05%, they being not significantly different statistically (χ²=0.750, P＞0.05, OR=0.75). GSTM1 gene deletion rate in the subcapsular epithelial cells of 20 cases was basically consistent with that in blood cells.Conclusion　GSTM1 gene deletion is not related to senile cataract formation.

　　【Key words】　Glutathione transferase　　Gene　　Cataract

　　据认为, 超氧化反应损伤是白内障发生的主要危险因素, 尤其在老年性白内障的病因学方面有重要位置。以往研究表明, 多种类型的白内障与超氧化反应(oxiclative damage)对蛋白^［1］、脂质^［2］、DNA^［3］的损伤有关。亦有报告指出，白内障与房水内H₂O₂含量增加有关^［4］。由于晶体蛋白的特殊性, 晶体较其它组织更依赖于机体抗氧化系统的保护作用。谷胱甘肽S转移酶(glutathione s-transferase, GST)是一组多功能蛋白质, 它不但可以催化还原型谷胱甘肽(reduced glutathione)与亲电子有害化合物结合, 而且可以非酶结合方式将体内各种内生或外源性具有潜在毒性的化合物排出体外。此外，尚有非硒依赖型过氧化物酶的活性, 消除脂类自由基^［5］。人体内主要有4种胞浆型GST-α、μ、π和θ及一种微粒体型。在GSTμ族中, 其中GSTM1在人群中存在表型差异, 而Seidegard等^［6］证实GSTM1的表型差异是由基因缺失所致。在GSTM1基因存在一种无效等位基因(null allele), 即该基因缺失, 表现为GSTM1酶活性缺失^［6，7］。该基因缺失率随人种的变化而不同, 约在20％～60％之间^［8，9］。有报告显示, 该基因的缺失与某些癌^［7，10］及白内障^{［10，11］}有关。本实验采用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction , PCR)方法对77例老年性白内障患者和76例健康对照者进行GSTM1基因检测, 现将结果报告如下。

　　资料和方法

　　1.研究对象: 白内障组为我院门诊或住院患者, 男52例, 女20例, 平均年龄71岁(52～82岁)。健康对照组系我院健康体检者, 男62例, 女14例, 平均年龄68岁(55～81岁)。所有研究对象均经裂隙灯显微镜及眼底镜检查确诊, 除外眼部其他疾病, 对照组最佳矫正视力≥1.0。

　　2.标本采集: 抽取被检者外周静脉血200 μl供GSTM1基因检测。白内障组中用22例在行白内障摘除术时, 取晶体前囊组织供晶体上皮细胞GSTM1基因检测。

　　3.GSTM1基因检测: （1）模板DNA制备: 外周全血200 μl, 基因组DNA依据皮静波等^［12］报告方法制备。将晶体前囊组织置微量离心管内, 直接加200 μl钾缓冲液(内含50 mmol/L KCl, 15 mmol/L Tris-HCl, 2.5 mmol/L MgCl₂, 0.5%Tween 20、100 μg/ml蛋白酶K), 56℃保温60分钟消化细胞, 95℃10分钟灭活蛋白酶K, 13 000 r/min离心5 min, 取上清备用PCR。（2）PCR反应条件: PCR引物设计参照Zhong等^［7］, 由我院分子生物学室合成。引物选择包含外显子4和5。P₁: 5′-CGCCATCTTGTGCTAC-ATTGCCCG-3′；P₂: 5′-ATCTTCTCCTCTTCTGTCTC-3′; P₃: 5′-TTCTGGATTGTAGCAGATCA-3′。总反应体积100 μl, PCR反应体系含200 μmol/L dNTP, 10 μl 10倍PCR缓冲液, 600 ng P₁, 300 ng P₂, 300 ng P₃, DNA模板10 μl, 2^U Tag DNA聚合酶。（3）扩增条件: 94℃变性1 min, 57℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 共30个循环。扩增后的基因产物行2％琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙啶染色; 于紫外检测仪下观察, 并照像。

　　4．统计学方法：采用χ²检验。

　　结果

　　1.PCR反应结果：白内障组(77例)和对照组(76例)共153例, 每个个体外周静脉血及22例白内障组的晶体上皮细胞,分别提取DNA后经紫外光度计定量, DNA为0.2～0.3μg, 样品纯度为吸光度（A）₂₆₀/吸光度（A）₂₈₀值为1.3～1.7。经PCR扩增反应后, 可得到所需的条带, 反应特异性好, 溴化乙啶染色后荧光强度亮, 易于观察统计(图1)。

图1　GSTM1和GSTM4基因扩增产物的电泳结果,每孔加10 μl扩增产物。M为DNA相对分子质量标准(pBR322/Hinf I)。157 bp的DNA片段在所有个体中均观察到，230 bp的DNA片段仅在包含GSTM1基因的个体中可见（4，6，8）

　　2.PCR扩增产物：本实验PCR反应体系中含有3个寡聚核苷酸引物, 其中P₁和P₃扩增产物为230 bp, 是GSTM1基因的特异产物, P₃只与GSTM1基因退火复性。P₁和P₂既可与GSTM1退火复性, 又可与GSTM4基因退火复性, 产物为157 bp, 该产物作为监测PCR反应的内参照(internal control)。

　　3.GSTM1基因频率：表1示GSTM1基因在正常组及老年性白内障组中的分布, 两组之间差异无显著性(χ²=0.730, P＞0.05，OR=0.75)。

表1　老年性白内障患者与对照组GSTM1基因频率

　　4.GSTM1基因缺失率比较：表2显示外周血细胞与人晶体上皮细胞中GSTM1基因表达有显著的一致性(χ²=18.16, P＜0.001)。

表2　老年性白内障患者外周血与晶体上皮GSTM1基因检测

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