中华眼底病杂志 1999年第4期第15卷 讲座

作者：费一坚

单位：美国耶鲁大学医学院眼科暨视觉科学科

　　编者按　视网膜变性疾病是内眼病和眼底病中的一大类较常发生并且致盲严重的眼病，由于这些眼病的病因、发病机制复杂和长期不明而治疗困难。只是在近年分子生物医学进展中，研究工作才取得较大进展。最近几年，视网膜变性疾病的研究进展很快，在不少方面有较大突破，为临床治疗的前景展现了曙光。本刊特将现在美国耶鲁大学医学院眼科暨视觉科学科的费一坚医师近期在该科所作视网膜变性疾病现代研究新进展与新动向的系列报告内容节录，作三个相关专题，分别在“讲座”栏中陆续刊载，以供眼科临床和科研工作者参考。

　　1　视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)的研究新进展

　　1．1　新发现的RP致病基因及其染色体定位与克隆分离(newly ldentified RP genes and their chormosomal localizations and cloning)

　　在发掘任何对遗传性视网膜病有效的治疗方法前，首先要弄清其遗传病因。也就是说首先要找出致病基因，然后克隆分离出致病基因，探讨其生物学特征、突变及分子致病机理。早期的研究应用遗传连锁分析技术结合显微染色体缺失(microdeletion)分析首次将RP的两个基因定位于X染色体短臂。定位于Xp11区者命名为RP₂，定位于Xp21区者命名为RP₃，我们应用传统多态遗传标记进行的连锁分析研究，也将RP的1个致病基因定位于1号染色体短臂，并被第九届国际人类基因定位会命名为RP₁。RP是具有遗传异质性的一组视网膜变性疾病。应用多态DNA遗传标记的连锁分析，结合新近采用的基因纯合性定位(homozygosity mapping)技术，现已发现了27个RP致病基因并进行了染色体定位。其中至少有4个RP基因位于1号染色体上，2个位于短臂(1p21，1p31)，另外2个位于长臂(1q13,1q31)。定位有RP致病基因的其它常染色体有2～4号，6～9号，11号，14～15号，17号及19号染色体。在定位于X染色体的5个性连锁(X-linked，XL)RP基因中，新定位的2个为位于X染色体长臂的(Xq26)RP₂₄及位于短臂的(Xq22．1)RP₁₅。有趣的是位于Xq22．1亚区的RP基因引起性连锁显性遗传(X-linked dominant)RP，一种新的，但罕见的RP遗传类型。

　　随着新的RP致病基因的定位及对已定位的基因进行更精确的亚区片段定位(refined mapping)，应用位置克隆(positional cloning)和染色体步移(chromosome walking)等分子生物学技术最近已对10个RP致病基因成功地进行了克隆分离。其中一些克隆的RP基因的基因产物已被鉴定(characterized)，对其蛋白的结构和生物学功能也有了初步的认识。例如定位于1号染色体短臂(lp31)的RP基因已于1997年被克隆，其编码视网膜色素上皮(retinal pigment epithetium,RPE)特异的蛋白，分子量为65×10³，取名为RPE₆₅。其功能涉及到视网膜维生素A的代谢与转运。1998年，Schwahn等应用位置克隆的方法分离克隆了位于Xp11．3区的RP₂基因。其编码的蛋白类似于人的C辅因子(human cofactor C)，可能涉及到细胞β-微管蛋白的拆叠功能(beta-tubulin folding)。位于Xp21．1区的RP₃基因已于1996年被Wright的研究组成功地克隆出。其编码RPGTP酶调节因子(retinitis pigmentosa GTPase regulator)，可能涉及到细胞内核与胞质间转运(nucleocytoplasmic transport)或信号传递通路(signal transduction pathway)，对这些RP新致病基因的定位和分离鉴定，是二十世纪末期视网膜变性疾病研究取得重大进展的标志之一。

　　1．2　RP基因突变研究的新发现

　　1．2．1　感光细胞视觉光电转化反应蛋白基因的突变　①视紫红质基因突变，采用候选基因方法(candidate gene method)，应用单链DNA构型多态性(single strand conformational polymorphism,SSCP)电泳筛选，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)产物直接进行DNA测序证实，仍是目前检测基因突变的主要手段。自从1990年Dryja等首次发现RP患者的视紫红质基因突变后，我们也应用PCR结合限制性长度片段多态性(restriction fragment length polymorphism)分析对RP家系患者的视紫红质基因进行分析，结果发现视紫红质基因突变是部分RP患者的发病原因。近年来，随着染料终止链反应自动测序(dye-chain termination automatic sequencing)等技术的应用，大大加快了基因突变的研究。迄今已发现RP中存在100多种视紫红质基因突变。有30%的RP患者是由视紫红质基因突变而发病。该基因突变不但能引起常染色体显性遗传型(autosomal dominant,AD)RP，也能导致常染色体隐性遗传型(autosomal recessive,AR)RP。新发现的AR型RP的视紫红质基因突变主要是无义突变(nonsense mutations)和拼接位点突变(splice site mutations)，突变的结果是产生无功能的视紫红质而引起RP。而显性突变(见于AD型RP)目前是认为产生有害的突变蛋白，从而干扰正常视紫红质的功能。关于突变的蛋白怎样引起RP的感光细胞凋亡，目前的初步看法是一些突变的视蛋白由于结构异常或糖基化(glycosylation)改变而滞留在感光细胞的内质网，不能运输到杆体外节盘膜中。另一些突变的视蛋白虽能转运到杆体外节但由于结构异常不能折叠(folding)，故未能整合入盘膜中或虽能插入盘膜但易引起盘膜结构不稳定而发生变性。发生于视紫红质第296位氨基酸即赖氨酸的突变，则可能是通过持续等光效应模式(constant equivalent light model)而引起感光细胞变性。即该突变使视紫红质丧失其与Ⅱ-顺式视黄醛(Ⅱ-cis retinal)的结合，正相当于持续光刺激引起的视紫红质光激活，而持续光暴露可导致感光细胞的光损伤而变性。但此模式在最近的转基因鼠(transgenic　mouse)研究中未得到证实。②杆体cGMP磷酸二酯酶(rod cGMP phosphodiesterase,cGMP-PDE)基因的突变。自从1993年Dryja等首次报告RP患者发生杆体cGMP-PDE的β亚单位(β-subunit)基因突变后，近年来又发现杆体cGMP-PDE的α(alpha-subunit)的基因也在AR型RP中发生突变。至今已发现约4%的AR型RP有不同类型的杆体cGMP-PDE基因突变。而多数β亚单位突变发生在含有催化活性区(catalytic domain)的C末端，故突变可直接降低cGMP-PDE对杆体细胞内cGMP的水解，引起细胞内cGMP升高而致感光细胞变性。近年应用靶基因置换技术建立的杆体cGMP-PDEγ亚单位(γ-subunit)基因失活的鼠模型中，发现γ亚单位突变也引起视网膜变性。③杆体cGMP控制的离子通道蛋白(rod cGMP-gated channel)基因的突变。受杆体细胞内cGMP水平控制的离子通道蛋白在光刺激引起的杆体细胞内cGMP下降时关闭，从而引起感光细胞膜超极化(hyperpolorization)，使光诱发的视觉信号向视网膜二级神经元传导。该离子通道蛋白有α、β、γ三个亚单位，但迄今仅有α亚单位基因突变在RP中发现。据估计，约有4%的AR型RP患者携带有杆体cGMP控制的离子通道蛋白α亚单位基因的突变。无义突变和缺失(deletion)突变不能产生功能性离子通道蛋白，而错义突变(missense　mutation)和移码突变(frame shift mutation)常引起C末端氨基酸丢失。在体外表达系统(in vitro expression)研究中发现此突变蛋白滞留在细胞内，不能整合到杆体细胞膜中。④视觉光电转化反应阻抑蛋白(arrestin)基因的突变。视觉传导的光电转化级联反应中，阻抑蛋白结合到磷酸化的视紫红质使光激活的视紫红质失活，从而终止光诱导的级联反应。Nakazawa等1998年报告对120个ARRP患者检测阻抑蛋白基因突变的结果，发现3个患者的阻抑蛋白基因第309位密码有1个碱基缺失突变(l-base-pair deletion mutation)。

　　1．2．2　感光细胞结构蛋白(photoreceptor structural protein)的基因突变　感光细胞盘膜边缘蛋白为感光细胞外段盘膜边缘的跨膜蛋白，其与胞内细胞骨架结构(cytoskeleton)相连接，对维持盘膜结构相当重要。该蛋白与缓慢型视网膜变性鼠(retinal degeneration slow,RDS)的致病基因产物高度同源(high homologue)，故又叫RDS。另一感光细胞结构蛋白为杆体外节段膜蛋白(rod outer segment membrane protein 1，ROM1)其DNA顺序55%与RDS相同，并以同型二聚体(homodimer)与RDS的同型二聚体结合形成四聚体(tetramer)，构成杆体外节盘膜的重要结构成分。AD型RP中RDS基因突变已有研究报告，而ROM1基因单独突变致RP者则极少见。最近Martinez-Mir等(1997年)报告1个PR家系的2个患者的ROM1基因发生双等位基因突变(doublemutant allele)，但其正常家系成员也有携带该突变者。自Kajiware等报告RP患者发生RDS与ROM1双基因突变(digenic　mutations)后，最近Jacobson等又发现了RDS基因的另外两个点突变与ROM1突变在RP家系中同时发生。携带这种突变的患者患有严重的RP，至今已发现RP患者中有39种RDS基因突变。双基因突变引起RP的发现，给RP的遗传病因学研究带来了全新的概念。

　　1．2．3　视网膜色素上皮蛋白(RPE₆₅)基因的突变　RP研究的重大突破。感光细胞结构与功能的完整性依赖于RPE的正常生理功能。长期以来一直推测RPE的遗传缺陷可能是引起RP的病因之一，对RCS(Royal College of Surgeons)大鼠视网膜变性的研究发现也支持这种推测，但缺乏直接证据。自从1997年编码视网膜色素上皮微体蛋白(microsomal protein)的RPE₆₅基因被克隆出后，该基因的突变逐渐在RP患者中发现。Marimura等1998年报告对147个AR型RP患者进行RPE₆₅基因14个外显子基因突变检测的结果，发现2%的RP患者携带有RPE₆₅基因突变。该基因编码的蛋白占RPE总蛋白的10%，常与视黄醇结合蛋白(retinolbinding protein)及11-顺式视黄醇脱氢酶(11-cis-retinol dehydrogenase)相伴随。故RPE₆₅的功能可能涉及到RPE中维生素A的转运和代谢。RPE₆₅基因的克隆及在RP中突变的发现，是近年RP遗传病因与病理机制研究中的重要进展之一。不但为RPE基因突变可导致RP提供了直接的证据，也为RP的发病机制涉及到维生素A代谢异常提供了遗传学证据。

　　1．2．4　视网膜维生素A代谢、转运相关基因的突变：RP病因新概念　维生素A在人类暗视觉功能中的重要作用及动物试验中剥夺维生素A饮食引起视网膜变性的研究发现，提示维生素A代谢的异常可能与RP的病因密切相关，但缺乏直接的证据。采用候选基因方法，检测RP患者中维生素A代谢所涉及的基因突变，Maw等1997年发现1个ARRP家系中的患者发生细胞视黄醛结合蛋白(cellular retinaldehyde-binding protein,CRALBP)第150位氨基酸的精氨酸突变为谷氨酸，且患者为该突变的纯合子。CRALBP正常情况下仅表达于RPE和视网膜的M%26uuml;ller细胞，而不表达于感光细胞。其功能是携带和转运11-顺式视黄醇和11-顺式视黄醛(11　cis-retinaldehyde)。在体外表达含此突变的重组CRALBP蛋白并检测其功能，结果发现突变的CRALBP溶解性降低，并丧失其结合11-顺式视黄醛的能力。表明CRALBP基因突变导致无功能的蛋白形成，通过干扰维生素A的正常代谢而引起视网膜变性。最近，本文作者等应用靶基因置换技术，选择性地灭活体内涉及视网膜维生素A代谢和转运的另一基因——视网膜感光细胞间视黄醇类结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein,IRBP)基因，结果发现该基因的缺失也可引起鼠视网膜变性。进一步为视网膜维生素A代谢转运缺陷是引起RP的直接病因之一的新概念提供了有力的遗传学证据。

　　1．2．5　视网膜ATP结合转运蛋白(ATP-binding cassette transporter-retinal,ABCR)基因突变　人类ABCR基因最近已被克隆分离，为感光细胞特异的ATP结合转运蛋白的编码基因。涉及到感光细胞能量传递及代谢物主动转运。ABCR为跨膜蛋白，含2个结合ATP的结构区(ATP-binding domains)及2个跨膜结构区(transmembrane domains)。Cremers等1998年报告了AR型RP家系4个RP患者发生ABCR基因5，端拼接点纯合突变(5 prime splice site mutation)。认为ABCR基因突变是部分AR型及散发型RP的重要分子缺陷。突变的ABCR蛋白可能通过影响感光细胞能量代谢，特别是视黄醇类转运及细胞内钙离子的储存与释放，而引起视网膜变性。

　　1．2．6　RPGTP酶调节因子(retinitis pigmentosa GTPase regulator,RPGR)基因突变　性连锁RP的遗传病因 定位于X染色体Xp21区的性连锁RP(RP₃)是最常见的XL型RP。1996年该型RP致病基因被克隆分离出，其编码视网膜GTP酶调节因子。该蛋白因子N末端有6～7个重复顺序与染色体浓缩调控蛋白(regulator of chromosome condensation,RCC)相同。可能涉及到细胞内信号传递及基因表达的调控。随着该基因的克隆与鉴定，RPGR基因的突变不断在XL型RP患者中发现。Buraczynska等1997年报告80个XL型RP家系中17个家系的患者发生RPGR基因的15种突变。据统计，RPGR基因突变引起的XL型RP在欧洲的XL型RP中仅占10%～15%，但在美国的XL型RP中占20%。不同类型的突变引起的临床表现也有差异。如RPGR外显子8～10的显微缺失引起严重的RP，而内含子10及13的拼接位点突变引起临床表现较轻的RP。

　　1．2．7　感光细胞基因调控蛋白(transcription factors of photoreceptor genes)基因突变　视网膜锥体-杆体同源盒基因(cone-rod homeobox gene,CRX)最近由三个研究组应用不同的分子克隆技术分别同时克隆出并弄清了其结构与功能。CRX是含DNA结合区及转录活性区的感光细胞基因调控蛋白。特异地表达于视网膜杆体和锥体细胞，与感光细胞的分化发育密切相关。自1997年，CRX基因的突变已不断在不同类型的视网膜变性疾病中检测出。Sohocki等1998年报告在晚发性AD型RP患者中发现CRX基因突变。CRX是几种视网膜感光细胞基因包括视紫红质、IRBP的转录调控蛋白。本文作者等应用体外细胞共转染及基因表达检测系统(in vitro cell co-transfection and assay for reporter gene expression)研究，发现CRX能高效地激活IRBP基因的感光细胞特异性表达。同时应用转基因鼠技术对IRBP基因的CRX结合区(CRX binding sites)进行体内突变分析，发现CRX是控制IRBP 在感光细胞中表达的主要调控基因。因而CRX突变可能通过其调控IRBP及视紫红质等感光细胞基因表达的功能丧失而引起各种类型的视网膜变性。

　　1．2．8　视网膜变性鼠同源基因“Tub”的突变　TULP₁(tubby-like protein　1)基因高度同源于引起鼠视网膜变性的基因“Tub”。由于其定位在6号染色体短臂6p21．3区，而该染色体区域含有RP的1个基因座位(RP₁₄)，以及“Tub”突变可引起鼠早发进行性视网膜变性伴耳聋及肥胖，因而TULP₁基因在RP病因学中的作用近来引起眼科及遗传学研究工作者的关注。Banerjee等1998年报告2个AR型RP(RP₁₄)大家系的33个患者均发生TULP₁基因的纯合拼接点突变，而50个遗传携带者发生杂合突变。表明TULP₁基因对视网膜功能有重要作用，其突变是部分AR型RP发生的病因。

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