中华眼底病杂志 1999年第4期第15卷 论著
作者：彭广华 李志杰 李辰
单位：510632 广州，暨南大学组织移植与免疫实验中心，眼科学实验室
关键词： 色素上皮，眼/免疫学；淋巴细胞；脱噬作用；流式细胞术
【摘要】 目的 观察视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞对体外抗原特异性活化淋巴细胞的影响，探索RPE细胞在眼免疫赦免中的作用。 方法 建立RPE与抗原特异性T淋巴细胞系和静止淋巴细胞之间的共培养系统。使用基因组DNA电泳、DNA末端标记和流式细胞技术检测凋亡的诱导情况。 结果 与RPE共培养的抗原特异性活化淋巴细胞出现凋亡征象。随着时间的延长，凋亡细胞的数量逐渐增加。定量分析表明：共育24小时的凋亡细胞占5．95％；48小时占9．38%；72小时占17．95%。与此相反，RPE对于静止的T细胞则不具有显著诱导凋亡的作用。 结论 RPE细胞具有诱导入侵淋巴细胞凋亡的能力。这种现象作为免疫反应的限制机制，在眼后节免疫赦免的维持和保护眼免受免疫性炎症反应中可能具有重要的意义。
中国图书资料分类法分类号 R774．1 R392．11 R446
Apoptosis of activated lymphocytes induced by retinal pigment epithelial cells in vitro
PENG Guanghua,LI Zhijie,LI Chen．
research Section of Ophthalmology ,Institute of Tissue Transplantation ＆ immunology,Jinan University,Guangzhou 510632,China
【Abstract】 Objective To examine the influence of retinal pigment epithelium(RPE) cells on antigen-specific activated lymphocytes in vitro,and to explore the role of RPE cells in the immune privilege of the eye． Methods Co-culture systems of rPE cells with antigen-specific T lymphocyte lines and resting T lymphocytes were established in vitro．Induction of apoptosis was detected by genomic DNA electrophoresis,DNA in situ end-labelling and flow cytometry． Results RPE cells induced apoptosis in antigen-specific activated T lymphocytes．24 hours after culture,the signs of apoptosis appeared in lymphocytes co-incubated with rPE cells．As time of co-culture went on,the number of apoptosic cells increased．Quantitative analysis of apoptosic cells showed that apoptosic cells accounted for 5．95% after 24 hours,9．38% after 48 hours,and 17．95% after72 hours．In contrast,RPE cells induced few apoptosis in resting T lymphocytes． Conclusions These results suggest that RPE cells possess the ability to induce the apoptosis of invading lymphocytes． This phenomenon serves as a restrain mechanism of immune response and may be of vital importance in the maintenance of immune privilege in posterior segment of eye and in the protection of eye from the damage of immunogenic inflammation．
【Key words】 Pigment epithelium of eye/immunology Lymphocytes Apoptosis
flow cytometry
最近的研究表明：眼组织特异性细胞在局部免疫调节中起着重要的作用［1］。将病毒抗原接种于眼前房，眼前节组织可以诱导入侵炎性细胞发生凋亡，从而限制了炎症反应的进一步扩散［2］。但这种机制是否也存在于眼后节组织还不清楚。本实验在体外培养条件下，建立RPE细胞和抗原特性活化淋巴细胞的共培养系统，观察RPE细胞对淋巴细胞的影响，以探讨RPE细胞在眼后节免疫赦免中的作用。
1 材料与方法
1．1 主要试剂 ①Iscove改良的Dulbecco培养基(Iscove's modified Dulbecco's medium,IMDM)、琼脂糖、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和完全弗氏剂(complets Freund's adjuvant,CFA)均为GIBCO产品；②碘化丙锭(propidium iodide,PI)、溴化乙锭(ethidium bromide,EB)、RNA酶(RNAase)A、胰蛋白酶、分离酶(dispase)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)均为SIGMA公司产品；③蛋白酶K为SERVA公司产品；④细胞原位凋亡标记试剂盒，由北京鼎国生物工程公司提供。
1．2 RPE的原代培养 按Chang等［3］的方法略加改进。摘除C57小鼠(Ⅱ级)眼球，2 U/ml分离酶浸泡，在体视显微镜下沿锯齿缘去除眼前节和玻璃体。从脉络膜和RPE层之间仔细分离得到带完整RPE层的视网膜，在IMDM培养液中，37 ℃放置15分钟，即可将RPE层从视网膜神经上皮层保持完整的分离下来，得到单纯的RPE。漂洗后0．25％胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为2×106/ml，含15%FBS的IMDM培养液接种于培养板中，待RPE细胞汇合。使用偶联罗丹明的毒伞素(Molecular probes,USA)标记肌动蛋白观察其分布模式来鉴别细胞［3］。
1．3 抗原特异性淋巴细胞系的建立 按照标准程序建立BSA抗原特异性T淋巴细胞系［4］。使用CFA和BSA混悬乳剂皮下注射预致敏C57小鼠。1周后无菌取脾脏，200目筛网研磨制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/ml。再加入10 μg/ml bSA培养5天。加入10 U/ml重组人IL-2再培养7天。通过加入抗原和IL-2进行再培养。3次循环刺激后，通过限制性稀释技术克隆建立T细胞系。
1．4 脾T淋巴细胞悬液的制备 取未致敏C57小鼠脾脏，过200目网制备单细胞悬液，红细胞裂解液裂解红细胞，此细胞作为静止淋巴细胞。
1．5 淋巴细胞、RPE细胞的共培养 共培养设置4组：①RPE细胞与抗原特异性活化淋巴细胞共培养组：待原代RPE细胞汇合后，吸除培养液，D-Hanks液洗涤后，每孔加入BSA抗原特异性淋巴细胞悬液2 ml(细胞数为1×106/ml)和0．5%BSA 50 μl进行孵育；②RPE细胞培养上清与抗原特异性活化淋巴细胞共培养组：原代RPE细胞汇合后，弃培养液，用IMDM完全培养液再培养24小时，取其上清液，加入BSA特异性淋巴细胞悬液2 ml和0．5％BSA50 μl进行孵育；③RPE细胞与静止淋巴细胞共培养组：待原代RPE细胞汇合后，吸除培养液，D-Hanks液洗涤后，每孔加入静止淋巴细胞悬液2 ml;④单纯抗原特异性淋巴细胞培养组：分别加入BSA特异性淋巴细胞悬液2 ml、0．5％BSA50 μl和完全培养液进行孵育。分别于24，48，72小时取出上述各组淋巴细胞进行下述实验。
1．6 DNA裂解片段的提取及琼脂糖凝胶电泳［5］ 将收集的上述各组淋巴细胞，苯酚-氯仿抽提DNA，2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外线下观察和拍照。
1．7 细胞原位凋亡标记 分别收集实验组和对照组的淋巴细胞。严格按照试剂盒提供的程序进行：4%多聚甲醛固定30分钟，2000 r／min离心5分钟，胎牛血清调整细胞浓度为4×106/ml涂片，阻断内源性过氧化物酶后加入末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)，37 ℃湿盒孵育60分钟(阴性对照片不加TdT酶，只加反应缓冲液)。加封闭液37℃湿盒作用30分钟后，然后加入反应液37 ℃湿盒作用30分钟，再加入显色反应液37 ℃暗盒作用20分钟，0．5%甲绿复染20秒，显微镜下观察细胞核内有蓝紫色颗粒者为凋亡阳性细胞。
1．8 流式细胞仪检测［6］ 分别收集与RPE细胞、RPE细胞培养上清共培养24，48，72小时的淋巴细胞，200目筛网过滤。70%冷酒精4 ℃固定1．5小时，2000 r／min离心5分钟，加RNA酶A(10 μg/ml)37 ℃水浴30分钟，再加PI(100μg/ml)染色，调整细胞浓度为1×106/ml,4 ℃避光过夜，流式细胞仪(FACS calibur B．D．，USA)检测。
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