【摘要】 研究慢性高眼压过程中大鼠视网膜核转录因子（NFκB）表达的变化及应用氨基胍 (amino guanidine,AG)对其表达的影响,探讨AG对慢性高眼压视网膜的保护作用。 方法:应用免疫组化和Western blotting的方法观察应用及未应用AG的慢性高眼压大鼠视网膜在不同时点的形态学变化及NFκB表达的变化。结果:随着高眼压时间的延长，视网膜逐渐变薄，节细胞数量减少；在此过程中，NFκB表达增多。慢性高眼压大鼠的视网膜应用AG者与未应用AG者相比,其形态学变化较小,而NFκB表达则明显增多。结论:NFκB是慢性高眼压视网膜损伤过程中的保护性因素，AG通过上调其表达发挥对视网膜的保护作用。
【关键词】 视网膜 慢性高眼压 凋亡 氨基胍 核转录因子
0引言
信号转导通路及凋亡相关基因是当今分子生物学的研究热点之一，青光眼损伤的最终共同病理通路是节细胞的凋亡。核转录因子NFκB是一种广泛存在于体内各种细胞的核转录因子，可以介导细胞存活信号,防止细胞凋亡。氨基胍 (amino guanidine,AG)是一种诱导型一氧化氮合酶(INOS)抑制剂，在青光眼的研究中报道较少,Neufield等［1］报道AG能起到对视神经的保护作用,但AG是否对慢性高眼压视网膜有保护作用及其机制尚不清楚。本实验通过检测应用及未应用AG的高眼压视网膜组织中NFκB表达水平变化,来探讨其表达与慢性高眼压视网膜节细胞的关系，AG是否通过参与慢性高眼压过程中对其NFκB的调控发挥保护作用。
1材料和方法
1.1材料
Wistar大鼠50只，由中国医科大学实验动物部提供，皆为雄性，体质量200～300g。实验动物及实验所用条件符合国家科学技术委员会的实验动物管理条例。随机分为3组：空白对照组10只（20眼），慢性高眼压模型组30只（60眼），慢性高眼压模型+AG组30只（60眼）。兔抗大鼠NFκB蛋白抗体，SABC试剂盒常山羊血清（武汉博士德公司）；N, N’亚甲双丙烯酰胺（美国BBI公司），N,N,N’,N’四甲基乙二胺（美国Fluka公司)，十二烷基磺酸钠（SDS）、二硫苏糖醇 (美国Sigma公司)硝酸纤维素膜（英国Amersham生命科学公司）。
1.2方法
浓度为100mL/L水合氯醛按0.3mL/kg 100g ip麻醉，剪开球结膜烧灼巩膜浅层静脉分支2支（烧灼成功标志:烧灼点远端巩膜浅层静脉血流消失，近角巩膜缘血管怒张，颜色加深），将球结膜复位，典必殊眼药水、膏滴眼。大鼠眼压用TonoPenⅡ型笔式眼压计测量，测量分别于术前、术后0.5h，7，14，21，28d进行。眼压超过术前（9～16mmHg）40%的手术眼为建模成功。AG应用组在造模前1d给予AG（美国Sigma公司产品），剂量按1g/L加入饮水中，总量控制在150mg/（kg·d）。然后，造模过程同上。取材、固定、脱水、石蜡包埋后按试剂盒说明进行操作。阳性细胞为胞质或胞核内有黄色或棕黄色颗粒沉积。每张切片分别选取5个不连续的高倍视野，采用etaMorph/BX51显微图像分析系统，测定阳性细胞的积分光密度（IOD）进行数据分析，判定阳性细胞的表达强度。将视网膜组织剪碎后加入100mL/L细胞裂解液，提取细胞蛋白质，SDSPAG电泳，转膜至硝酸纤维素膜，经脱脂奶粉中和后，与抗Caspase9一抗二抗作用，辣根过氧化物酶标记，DAB显色。
统计学处理：统计结果均以（±s）表示，用SPSS13.0软件进行统计分析。用药组与未用药组均数间的比较用t检验分析，模型组与对照组的比较用oneway ANOVA检验分析。
2结果
2.1慢性高眼压大鼠视网膜节细胞和神经纤维层的厚度的变化
造模后21d起，大鼠视网膜厚度开始变薄，节细胞数量减少，而用药组变化较小。Levene方差齐性检验，P＞0.05方差齐，oneway ANOVA分析P＜0.05，故认为大鼠和神经纤维层厚度在3组中至少有一组与另外一组差异显著；组间多重比较检验表明各组与对照组相比厚度的差异均有统计学意义；未用药模型组与用药模型组相比厚度的变化有统计学意义(P<0.05，表1)。表1 各组大鼠视网膜厚度变化（略）
2.2免疫组化方法检测NFκB表达分布及强度
正常大鼠视网膜仅在神经节细胞层有微量阳性表达，免疫阳性细胞为黄褐色细胞核或浆染色，第3d起表达开始升高，7，14d时表达最强，神经节细胞层可见于胞体大而圆的神经节细胞，也可见于胞体细长核深染的小胶质细胞呈阳性反应（图1，2）。除神经节细胞层外阳性细胞在内核层也有多量表达。但在视锥、视杆细胞几乎没有见到阳性表达。第28d仍有较多细胞核呈黄褐色。应用AG后，NFκB在相同时点表达均增强（表2）。表2 各模型组大鼠视网膜NFκB表达强度即积分光密度值（略）
2.2 Western blotting方法检测NFκB蛋白的表达
NFκB蛋白的表达随着高眼压时间的延长而增强，第7d和14d尤为明显，之后有所下降（图3）。Levene方差齐性检验P＞0.05方差齐；oneway ANOVA分析P＜0.05，NFκB蛋白在不同时点的表达至少有一个时点与其他时点的差异有显著性；各时点间多重比较（Turky法）表明除高眼压3d组外，各时点与对照组的差异有统计学意义。用药模型组NFκB蛋白的表达与未用药组比有明显增强，二者间的比较t检验P＜0.05，说明用药模型组与未用药模型组NFκB表达的差异有统计学意义（表3）。表3 各模型组大鼠视网膜NFκB蛋白表达相对吸光度比值（略）
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