【摘要】 目的：观察在高原环境下Nogo在北京青紫蓝兔视网膜中的表达和分布。方法：北京青紫蓝兔24只随机分为实验组20只，对照组4只，分别喂养于高原环境和亚高原环境中1，3，7，10，14d取出兔眼球，制成蜡片，应用免疫组化的方法检测视网膜中Nogo的表达及分布。结果：在高原环境下Nogo在兔视网膜中的表达增多，7d达到高峰，持续到10，14d下降，与对照组比较，差异有统计学意义。结论：在高原环境下，Nogo在视网膜急性缺血缺氧损伤可能发挥了重要作用。
【关键词】 视网膜 勿动蛋白 免疫组化
0引言
高原地区气压低、缺氧、太阳红外线及紫外线辐射较强，研究表明，高原低压性低氧是致病的主要因素。神经系统对缺氧的耐受性最差，特别是大脑中枢神经系统对缺氧最为敏感，而视网膜来自胚胎的原始视杯，属于脑的一部分，与中枢神经关系密切。进入高原，机体最先出现缺氧症状的就是视觉系统，视网膜组织结构复杂而且精密，新陈代谢极为旺盛，微循环障碍会造成视网膜组织缺氧，导致变性坏死。我们检测Nogo在高原环境下北京青紫蓝兔视网膜的表达与分布。
1材料和方法
1.1材料
北京青紫蓝兔（兰州生物研究所提供）体质量2.5～2.8kg，雌雄不限，24只。符合国家医用动物使用标准。将24只北京青紫蓝兔随机分为两组，20只为实验组，4只为对照组， 将实验组20只北京青紫蓝兔喂养在海拔为3840m的高原环境下，对照组4只喂养于1520m的亚高原的环境中，分别于1，3，7，10，14d各处死4只。
1.2方法
取材固定：用耳缘静脉注气法处死动物，立即摘除眼球，于角巩膜缘后5mm处开窗后，固定于40g/L多聚甲醛中1wk。环行切取角巩膜缘后5mm视网膜后极部包括视神经的厚约5mm的眼球组织，常规脱水、透明、石蜡包埋，连续切片6张，片厚4μm，裱片于经APES（多聚赖胺酸）处理的载玻片上，烘干6h以上，行HE染色和免疫组织化学染色。切片用PBS洗3次，共15min：滴加30g/L的双氧水，室温10min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次，共15min；滴加50g/L BSA封闭液，室温20min，甩去多余液体，不洗；每一标本切片分为2组，分别滴加稀释的一抗(抗NogoA，稀释比例为1∶200)，置冰箱4℃过夜（约15～16h）；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温20min，用PBS洗3次，共6min；滴加即用型试剂SABC（SA1022），室温20min，用PBS洗4次，共20min；按说明书配制DAB显色剂(AR1022)滴在切片上，室温显色10min；蒸馏水洗涤，终止显色，苏木素轻度复染，然后脱水，透明，封片。显微镜观察，视网膜阳性表达物为棕黄色颗粒。视网膜各层中着色呈棕黄色为Nogo表达阳性。随机取对照组及实验组兔视网膜各5张切片，将其输入图像分析系统进行处理，在10×40倍视野下，每个时间点，各10个视野，测定吸光度值，取其平均值。
统计学处理：统计学资料采用SPSS11.5软件包，以单因素方差分析（oneway ANOVE）进行处理，比较高原组和对照组以及高原组各个时间点Nogo的表达变化。
2结果
实验组在不同的时间点，Nogo在视网膜各层中的表达也不同。实验1d，视神经节细胞层及外界膜的表达最强烈，在外丛状层内核层内丛状层也有少量表达；实验3d，视神经节细胞层及外界膜的表达仍强烈，外核层外可见轻度表达。实验7d，内界膜到外界膜均可见表达，外核层外可见表达加强（图1A～E）。实验10d，在内核层及内界膜的表达。实验14d，主要在神经节细胞层及外界膜表达。对照组Nogo主要在神经纤维层、节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层均出现轻度表达，其中以节细胞层最明显（图1F)。对照组（189.3±78.1）与高原实验组1d（252.6±92.7），3d（267.0±74.3），7d（345.3±108.1），10d（389.5±54.1），14d（257.2±70.1）比较，兔视网膜Nogo吸光度值有显著统计学意义（F=6.211，P＜0.01）在高原实验组中1d组分别与3，7，10，14d比较，1d与3d，14d组兔视网膜Nogo吸光度值差异无统计学意义（P＞0.05）,1d与7d、10d组兔视网膜Nogo吸光度值差异有统计学意义（P＜0.05）。
3讨论
2000 年，3 个实验室(美国、瑞士、英国) 同时报道了抑制神经再生基因—Nogo 基因[13]。Nogo基因转录3种蛋白, 即NogoA,NogoB 和NogoC,Nogo蛋白本质上属于网状蛋白(Reticulon)家族成员,即Ret4A,在3种异构体中,NogoA最长,含有1163个氨基酸,分子质量为126kDa,富含酸性氨基酸和脯氨酸,含有一个较大的胞外结构域(1024个氨基酸残基和7个N糖基和多个O糖基化位点)、2～3个跨膜结构域和一个短的胞内域。氨基端有一172个氨基酸序列,没有亲水的信号序列,蛋氨酸是其起始序列,羧基端由188个残基组成,包含两个疏水结构域(35个和36个氨基酸),二者被一包含66个残基的亲水结构域(Nogo66)分开。和其他髓鞘蛋白一样,羧基端有个双赖氨酸的内质网定位信号[2]。NogoA全长存在2个抑制性功能域:一个是可能位于细胞表面的Nogo66,另一个是长的氨基端区段(NiG),有实验显示这两个结构域在抑制轴突生长方面发挥着协同作用,如果NiG位于胞内,那么只有在髓鞘损伤后NogoA的氨基端才表现为抑制作用[1,4]。其拓扑结构目前认为有3种可能:1)NogoA的氨基端和羧基端位于胞液内,而Nogo66位于内质网腔外或胞外;2)Nogo66位于胞液中,其余部分位于内质网腔外或胞外;3)Nogo66与其氨基端位于胞液中,其余部分位于内质网腔外或胞外。序列分析表明，NogoA与NogoB和NogoC一样,不含任何已知的细胞粘附因子、胞外基质分子、轴突引导分子的基序,也没有其他神经生长抑制因子诸如semaphorins,netrins和ephrins的同源序列[5,6]。
研究表明[7]，眼球挫伤后Nogo 的表达,为可能的神经元修复作准备,起定向作用,保证神经通路的准确无误，但同时也给神经元修复设置了障碍,神经元一碰到Nogo 就会停止生长或转向生长,从而抑制了神经元的再生。本研究表明，不论在视网膜缺氧状态下还是在正常条件下，Nogo都是在视网膜神经节细胞层表达最强烈，但是在缺氧状态下的表达比正常条件下要明显增加，我们推测，Nogo参与了视网膜在急性低氧环境中的病理性变化，在3d出现明显变化，7d时达到高峰。将Nogo基因敲除或者抑制Nogo基因的表达，可能会促进视网膜的修复，但是是否会导致神经元的乱生，Nogo在正常状态下可能发挥某些特定的作用，关于其机制仍需要进一步研究，其特点可为进一步研究视网膜损伤后再生与修复提供新的思路。
【参考文献】
1 Chen MS, Huber AB, vander Haar ME, et al. Nogo2A is amyelin associated neurite outgrow th inhibitor and an antigen formonoclonal antibody IN 21. Nature 2000;403:434439
2 GrandPre T, Nakamura F, Vartanian T, et al. Identification of the Nogo inhibitor of axon regereration as a reticulon protein. Nature 2000;403:439444
3 Prinjha R, Moore SE, Vinson M, et al. Inhibitor of neuriteoutgrowth in humans. Nature 2000;403:383384
4 Woolf CJ, Bloechlinger S. Neuroscience. It takes more than two to Nogo. Science 2002;297(5584):11321134
5 Taketomi M, Kinoshita N, Kimura K, et al. NogoA expression in mature oligodendrocytes of rat spinal cord in association with specific molecules. Neurosci Lett 2002;332(1):3740
6燕振国,刘敬美,金尚丽.高原环境兔眼球钝挫伤后视网膜NGF和Nogo的表达.国际眼科杂志 2007;7(4):960964 |
