【摘要】 目的：通过观察在大鼠急性高眼压模型中视网膜一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase, NOS）分布及含量的变化，并检测视网膜丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平的变化，探讨氨基胍（aminoguanidine, AG )与倍他洛尔（betaxolol）对大鼠高眼压视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。方法：采用前房穿刺加压法建立大鼠缺血再灌注损伤模型，维持灌注时间60min。将各组右眼球经视神经矢状切片标本做HE染色进行视网膜组织学观察，还原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶（NADPHd）法检测视网膜NOS染色阳性的细胞数，硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid, TBA）法测定各组左眼球视网膜MDA含量。结果：各组视网膜均有NOS表达，NOS阳性细胞在视网膜主要分布于视网膜节细胞层（ganglion cell layer, GCL）、内丛状层（inner plexiform layer, IPL）、内核层（inner nuclear layer, INL），200倍视野计数生理盐水组视网膜GCL的NOS阳性细胞数明显高于空白对照组（P<0.01）；AG与betaxolol药物治疗各组的NOS阳性细胞数较生理盐水组减少（P<0.05）；视网膜NOS阳性细胞数与视网膜MDA含量增减呈正相关性(r=0.69,P<0.01)。结论：AG通过对诱导型NOS的抑制在大鼠高眼压诱导视网膜损伤中起到视神经保护作用。betaxolol通过抑制钙通道，使NO的生成减少，增加抗氧化能力，从而起神经保护作用。
【关键词】 一氧化氮 氨基胍 倍他洛尔 高眼压 视网膜
0引言
倍他洛尔(betaxolol，商品名贝特舒)是一种高选择性β1受体阻滞剂，兼有Ca2＋通道阻滞作用，临床已用于降眼压治疗，关于倍他洛尔对青光眼患者具有视神经保护作用的研究，国内少有相关报道。氨基胍（aminoguanidine, AG）是iNOS的相对特异性抑制剂，Neufeld等[1]报道,在大鼠慢性青光眼模型中，AG能起到视神经保护作用，但对急性情况不明。我们利用前房加压法模拟青光眼制造大鼠视网膜缺血再灌注模型，选择NADPHd（还原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶）免疫组化的方法检测NOS活性，用以间接反映视网膜NO的水平，并检测视网膜MDA水平的变化，旨在探讨betaxolol与AG对大鼠高眼压视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。
1材料和方法
1.1材料
健康成年SD大鼠2～3mo龄共27只，体质量180～220 g，无眼疾（外形正常，角膜透明），雌雄均有（南京医科大学实验动物中心提供，实验动物及条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》）。随机分为空白对照组3只鼠，余24只大鼠施行高压前房灌注，维持时间60min。分别于高眼压60min后， 24只鼠分为高眼压生理盐水组、betaxolol治疗组、AG治疗组和betaxolol+AG联合治疗组，再根据再灌注时间的不同，又分为再灌注后1，7d组，每组3只6眼；2.5g/L倍他洛尔滴眼液(美国Alcon公司)，NADPHd（还原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶，Roche公司，美国），AG由北京理工大学亘元医药公司提供，NBT（硝基四氮唑蓝，Roche公司，美国），MDA试剂盒（南京建成生物化学试剂公司），Leica冰冻切片机及显微镜，Leica Qwin QG2232 V2.3图像分析处理系统。
1.2方法
动物模型的建立参照文献[2]，采用前房穿刺加压法建立大鼠缺血再灌注损伤模型。模型建立的观察：Healon针头置入大鼠前房，升高输液瓶高度至距大鼠眼的垂直距离136cm，此高度差可在大鼠眼内形成100mmHg的眼内压，维持灌注时间60min，施行前房高压灌注后，可观察到大鼠前房明显加深，用直接检眼镜观察大鼠眼底，以眼底视网膜动脉血流中断、球结膜苍白为视网膜缺血成功标准;，数分钟后可见角膜水肿呈雾状,灌注完毕拔除Healon针头后，穿刺口附近虹膜可见少量出血。丢弃穿刺口漏水，前房不能形成或前房明显积血或针头误伤晶状体，形成白内障的大鼠，重新补充实验大鼠。术后给予氯霉素眼液、红霉素眼膏预防感染。2.5g/L betaxolol眼药水在开始缺血前及灌注时点眼2次，此后每天2次(09∶00/10∶00和20∶00/21∶00)，每次1滴；AG用法为100mg/kg腹腔内注射，每日2次；联合治疗组用法同上。造模术后1，7d（每个时间点6只大鼠）分别用30g/L戊巴比妥30mg/kg,ip麻醉大鼠后，经左心室插管至主动脉快速灌注生理盐水100mL，再用40g/L多聚甲醛500mL维持灌注2～3h。术毕分别取眼球，于40g/L多聚甲醛中后固定2～3h后，置于300g/L蔗糖溶液中4℃过夜，待组织标本沉底后取出，经视神经做眼球的矢状切片，片厚30μm，隔2选2，置于0.01mol/LPBS（磷酸盐缓冲液，ph7.4）中待用。
1.2.1 NADPH黄递酶法检测NOS[3]
冰冻切片标本用0.01mol/L PBS重复漂洗3次，每次3min。然后置于孵育液中，在37℃温箱孵育60～90min。孵育液由0.6g/L NADPHd,0.6g/L NBT,3mL/L TritonX100和0.1mol/L PB（磷酸缓冲液，ph8.0）组成。染色完成后加入0.01mol/L PBS冲洗3次，每次3min，终止反应。常规脱水，中性树脂封片。
1.2.2 MDA含量的测定[4]
将上述各组对侧左眼球摘除后置于4℃冰生理盐水中，眼科小梁剪沿角巩膜缘后0.5～1mm剪除角膜，轻挤压弃去眼前节、晶状体及透明的玻璃体,用眼科显微镊夹住后部眼杯在液体平皿中涮一下，灰白色的视网膜就飘在液体中，剪短与视神经连接处得到灰白色的视网膜组织。硫代巴比妥酸（TBA）法测量MDA含量，测量方法和步骤严格按试剂盒说明书进行。
统计学处理:应用SPSS10.0版软件进行统计学分析。组间方差分析采用F检验，两两比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异显著。
2结果
空白对照组视网膜分层清晰，各层结构没有明显异常。内外颗粒层细胞分布均匀、空隙少。高眼压非治疗组视网膜内外颗粒层明显肿胀，细胞排列紊乱密度低，外颗粒层感光细胞之间空隙增大，内颗粒层细胞分散、有大量空泡。药物治疗各组视网膜分层清晰，外颗粒层感光细胞有缺失，内颗粒层细胞分散偶见空泡（图1）。各组视网膜均有NOS表达，NOS阳性细胞在视网膜主要分布于GCL、IPL、INL，200倍视野计数生理盐水组视网膜GCL的NOS阳性细胞数高于空白对照组，在 1d组升高差异显著（t=20.02,P<0.01）；药物治疗各组的NOS阳性细胞数较生理盐水组减少，其中联合用药组较生理盐水组在1d时间点时比较减少差异显著（t=16.66,P<0.01），联合用药组较空白对照组在7d时间点时比较，NOS阳性细胞数减少无显著性差异（t=0.68,P>0.05）。高眼压生理盐水组MDA含量较空白组升高（t=2.60，P＜0.05），药物治疗各组的MDA含量较生理盐水组降低（表1），视网膜NOS阳性细胞数与视网膜MDA含量增减呈正相关性(r=0.69，P＜0.01)。表1 视网膜GCL NOS阳性细胞数及MDA含量（略）
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