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3讨论
采用生理盐水高压前房灌注建立大鼠急性高眼压模型，这种模型制作方便、周期短、易重复并且眼压水平量化、调整方便，所造成的视网膜损伤以RGC首先受损，与青光眼的视神经损伤发生相仿，是研究高眼压早期视神经损伤的理想动物模型。国外有学者[1,5]采用兔前房内注射α－糜蛋白酶或用结扎涡静脉等方法用以升高眼内压模拟青光眼模型，也有将大鼠的小梁网用激光瘢痕化，增加房水循环阻力来升高眼内压，这些方法与人类青光眼的形成机制相似，但眼内压不易量化且不易控制试验过程，故一般较少采用。视网膜缺血再灌注后组织学变化与视网膜缺血的程度、持续的时间、不同的组织细胞及其所处的状态等因素有关，因此，研究结果存在差异。但是，视网膜缺血之后，随着再灌注时间的延长，其组织学变化常遵循一定的规律。一般来说，早期以水肿为主，晚期以细胞变性、萎缩及死亡为主。Takahashi等[6]研究发现,缺血再灌注7d以后，组织学的变化趋向于稳定，因此，人们将缺血再灌注1d和7d作为重要的时间点，研究此时的组织学变化[7]。NO是无机气体小分子，性质高度活泼，半哀期极短.仅为3～5 s，很难对其进行定位研究，一般以观察NOS的分布来确定NO的生成部位，以此来间接研究NO的有关作用，由于NADPHd组化染色经济、简便，所以人们常用NADPHd组化的方法研究NOS神经元的分布。丙二醛（MDA）是各类自由基攻击细胞膜中不饱和脂肪酸后形成的脂质过氧化稳定产物,通过测量MDA含量可以推测脂质过氧化反应强度和组织损伤的程度。
NOS在眼内含量丰富，体内存在3种由不同基因编码的异构体：nNOS,iNOS和eNOS (endothelial NOS)，其中nNOS和eNOS在生理条件下就能表达，其活性依赖于Ca2+和CaM（钙调蛋白）。我们发现，在空白对照组大鼠视网膜GCL、IPL和INL均有NOS表达，说明NO可能参与眼生理状态下的调节。高压灌注后的大鼠视网膜GCL变薄，升高眼压60min后各时间段检测NOS水平，发现视网膜的NOS表达相应增高。Liu等[8]在压力仓内人工培养视神经胶质细胞，增加细胞周围静水压至60mmHg，细胞内逐渐开始出现iNOS，24h后达高峰，并通过免疫组化及蛋白印迹法证实了iNOSmRNA的出现，提示直接给予压力也可诱导iNOS的产生。因此我们推测本论文中视网膜高表达的NOS可能主要为iNOS。由此产生的iNOS是一种仅在病理状态下才会表达的非钙离子依赖性酶，主要在视网膜缺血后期表达，iNOS的活性不依赖于Ca2+/CaM，其受创伤、缺血、内毒素、感染等因素诱导产生，参与机体的病理生理过程，作用缓慢而持久，iNOS RNA半衰期特别长，可持续长时间翻译合成 iNOS，由此产生 NO的量大，对视网膜组织的损伤也特别大[9]，因此研制高选择性、高效、低毒的 iNOS抑制剂对治疗缺血性视网膜疾病犹为重要。
大多数NOS抑制剂为非选择性抑制剂，可同时抑制3种NOS，不但抑制了具有病理作用的NOS的产生，同时抑制了具有生理作用的eNOS [10]。氨基胍是一种肼复合物，Corbett等于1992年首次报道了它具有高选择性抑制iNOS的作用，是近年研究较多的iNOS抑制剂，较非选择性NOS抑制剂NG硝基L精氨酸甲基酯（LNAME）对iNOS的抑制作用强7倍，并且AG对iNOS的抑制作用是持续的。AG抑制iNOS的机制是与其催化部位的血红素铁结合，抑制iNOS合成，阻断作为自由基的NO生成，降低NO的细胞毒性作用及其潜在的基因毒性，起到视网膜节细胞的保护作用[11]。我们发现，高眼压后AG治疗组NOS阳性细胞数较生理盐水组对照明显减少，反过来进一步证实了本实验中视网膜高表达的NOS主要为iNOS。有研究表明氨基胍对心、脑、肾及血压的影响很小，重要的是氨基胍本身对眼压无任何影响，所以AG作为高度选择性，高效低毒的iNOS抑制剂为缺血性视网膜疾病的治疗提供了新思路。
倍他洛尔（贝特舒， betaxolol）是一种β1肾上腺素受体拮抗剂，在眼部青光眼治疗中通过阻断睫状上皮β1肾上腺受体减少房水生成而降低眼压。在降眼压的同时它还可以抑制电压门控钙通道和NMDA受体门控钙通道，继而降低在缺血和损伤中引起的谷氨酸受体过度激活，以及之后的下游介质的激活、自由基形成、细胞凋亡而影响RGC的生物学功能，从而起神经保护作用[12,13]。为减少betaxolol对心、脑、血管的影响，本论文中betaxolol治疗组采用滴眼剂局部治疗，发现在药物干预1d视网膜NOS阳性细胞数较高眼压生理盐水组明显减少，而在7d减少较1d无明显差异（P>0.05），所以我们分析betaxolol可能在缺血再灌注早期通过阻断Ca2＋内流,减少Ca2＋依赖性nNOS的激活,使由nNOS催化的NO生成减少。我们还发现，视网膜MDA含量与视网膜NOS阳性细胞数的增减呈正相关性，这是由于NO本身可以作为自由基与超氧阴离子（O2）结合形成超氧亚硝根离子（ONOO），ONOO其共轭酸ONOOH可裂解生成氧化能力更强的OH，使生物膜不饱和脂肪酸发生过氧化反应，形成过氧化脂质（如MDA）。药物治疗各组MDA含量均明显低于高眼压模型后非治疗组，说明AG与Betaxolol均有抑制自由基的过多生成、减轻视网膜脂质过氧化反应的作用。
本论文结果显示，NOS阳性细胞数在联合应用betaxolol及AG组与高眼压生理盐水组比较NOS阳性细胞数减少差异显著(P<0.01)，而与空白对照组比较无统计学差异(P>0.05)，表明高眼压视网膜缺血再灌注后及时应用betaxolol与AG可使视网膜中NOS显著减少甚至恢复正常水平。由此可见，联合应用betaxolol与AG以减少不同时期不同类型NOS的表达,进而减少NO的产生及细胞毒性作用，可能有望成为治疗高眼压视网膜缺血再灌注损伤的有效措施，具体给药方式及剂量有待进一步探讨和研究。
【参考文献】
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2牛膺筠,张瑞,周占宇,等.碱性成纤维细胞生长因子对鼠视网膜缺血再灌注损伤的治疗作用.中华眼科杂志 2002;38(9):5303马瑞,肖明,顾振,等.在大鼠生长发育中翼腭神经节一氧化氮合酶阳性神经细胞的变化.南京医科大学学报 2002;22(6):476478
4荣华,艾明,邢怡桥,等.倍他洛尔对实验性视网膜缺血再灌注损伤后视神经的保护作用.中华眼底病杂志 2005;21(4):250
5 Yucel I, Akar Y, Yucel G, et al. Effect of hypercholesterolemia on inducible nitric oxide synthase expression in a rat model of elevated intraocular pressure. Vision Res 2005;45(9):11071114
6 Takahashi K, Lam TT, Edward DP, et al. Protective effects of flunarizine on ischemic injury in the rat retina. Arch Ophthalmol 1992;10:862870
7周跃华,李志辉,孙葆忱.缺血性视网膜损伤机制的研究.国外医学眼科学分册 1999;23:16
8 Liu B,Neufeld AH,Neufeld.Nitric oxide synthase2 in human optic nervehead astrocytes induced by elevated pressure in vitro. Arch Ophthalmol 2002;119:240245
9 Sakamoto K, Yonoki Y, Kubota Y, et al. Inducible nitric oxide synthase inhibitors abolished histological protection by late ischemic preconditioning in rat retina. Exp Eye Res 2006;82(3):512518
10 Jiang MH, Omohiro K, Junichi H, et al. Different effects of eNOS and nNOS inhibition on transient forebrain ischemia. Brain Res 2002;946:139147
11胡博,詹江华,崔华雷,等.氨基胍对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用.临床儿科杂志 2006;24(8):689691
12 Hester RK, Chen Z, Becker EJ, et al. The direct vascular relaxing action of betaxolol, carteolol and timolol in porcine long ciliary artery. Surv Ophthalmol 1999;38:125134 上一页 [1] [2] |
