【摘要】目的：探讨一定大小的乳化硅油小滴能否影响视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial , RPE）细胞的吞噬能力。方法：将硅油挤压通过一种微孔滤膜制成大小相似的小滴。用酞箐蓝标记硅油小滴。培养的人RPE细胞与硅油小滴，伴或不伴有血清，共同孵育24h。被细胞内吞的小滴在显微镜下计数。测量人RPE细胞在体外吞噬硅油小滴的数量。结果：挤压通过这种微孔膜制成的硅油小滴至少稳定5d，硅油小滴的直径为4.25±0.77μm。乳化硅油浓度不同，RPE细胞吞噬硅油小滴的数量有明显剂量依赖性，随浓度增高，吞噬数量也增加。加有血清的硅油小滴使RPE细胞的吞噬能力进一步增强。结论：硅油小滴能刺激RPE细胞的吞噬能力，含有血清时对RPE细胞的吞噬能力有进一步的刺激作用。

   【关键词】  色素上皮　眼　硅油　乳化　吞噬

　　Effects of vesicles of silicone oil on phagocytosis of human retinal pigment epithelial cells in vitro

    Li-Na Ma, Yan-Nian Hui, Yu-Sheng Wang, Le Zhang, Qing-Bo Wang, Jian-Feng Xu, Ji-Xian Ma

    Department of Ophthalmology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China.

     Abstract  AIM: To investigate whether the phagocytosis potentiality of retinal pigment epithelial (RPE) cells can be influenced by emulsified silicone oil droplets with a certain vesicle size. METHODS: Similarly sized vesicles of silicone oil were produced by extrusion of oil through a micro-pore filter membrane. Vesicles of silicone oil were labeled and monitored with phthalocyanine blue dye. Cultured human RPE cells were incubated with labeled silicone oil vesicles and with or without serum for 24 hours. The numbers of the vesicles engulfed in the RPE cells were counted under a microscope. The main outcome measure was the ability of RPE cells to phagocytize the vesicle numbers of silicone oil in vitro. RESULTS: Extruding silicone oil through the membrane resulted in the production of vesicles that remained stable for at least 5 days. The mean vesicle diameter was 4.25±0.77μm. Vesicles of silicone oil had a dose-dependent influence on RPE cell phagocytosis. The more the concentration of the vesicles, the more phagocytosis the cells did. Phagocytosis of the vesicles by cultured RPE cells was also stimulated by serum added in the culture medium.CONCLUSION: These in vitro data show that vesicles of silicone oil are stable once emulsified. Vesicles of silicone oil can stimulate the ability of RPE cell phagocytosis. The serum can further stimulate the ability of the phagocytosis.

    · KEYWORDS: pigment epithelium of eye; silicone oil; emulsification; phagocytosis

　　 0引言

    硅油又称为聚二甲基硅氧烷，理化性质稳定。没有生物毒性、透光和屈光性好、粘稠度高、能限制玻璃体腔内的增生细胞和生化介质的移动，可能限制增生性玻璃体视网膜病变，并且具有机械性抑制增生膜的牵引作用，能有效封闭裂孔。目前硅油广泛用于治疗复杂孔源性视网膜脱离，特别是复杂视网膜增殖性疾病。但眼内长期放置硅油可引起许多并发症，其中硅油乳化是较严重的一种。硅油乳化是指小而稳定的硅油小滴与玻璃体内硅油大泡分离并扩散进入眼组织的一种过程。此时，乳化硅油对限制玻璃体腔内的增生细胞和生化介质移动的能力降低，封闭裂孔的能力也降低。在视网膜表面的一些地方，硅油小滴黏附紧密，很难用机械的方法将其冲洗干净。张少冲等[1]对玻璃体腔注射硅油患者的这些部位进行了视网膜光学相干断层扫描(optical coherence tomography, OCT)，发现均有视网膜下膜的形成，视网膜色素上皮细胞也有增殖。乳化硅油可能刺激膜形成和随后的增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy, PVR）反应。吞噬细胞可能被硅油小滴活化，即吞噬等能力增强，并吞噬一定大小的小滴。因此我们在体外用人眼视网膜色素上皮（RPE）细胞分析硅油小滴对其吞噬活性的影响。

    1材料和方法

    1.1材料 硅油小滴使用微孔膜乳化法制备。粘度为 5 700mPa·s硅油0.05mL在1个大气压的乳化压下通过孔径为0.45μm的纤维素微孔膜，分散于10mmol/L PBS 0.95mL液中。向1mL乳化硅油液中加入油溶性染料酞箐蓝10μg，该染料不溶于PBS，能均匀溶于硅油。充分振荡，使染料均匀着染硅油小滴。利用光学显微镜可以直接观察硅油小滴大小，并通过对拍摄照片的分析，计算出硅油小滴的直径。硅油小滴样本由制得乳化硅油液中央吸取，随机吸取3滴样本，每滴样本随机取3个视野，每个视野至少测量50个硅油小滴，用图象采集分析系统(Image－Pro Plus 6.0)测量小滴直径。重复实验3次。

    1.2方法 RPE细胞系为原代培养人RPE细胞，由第四军医大学西京医院王静波博士惠赠。细胞复苏后，Eagle培养液(delbeccos modified Eagles medium , DMEM , Gibco , USA )中加入100mL/L新生牛血清（四季青产品）、青霉素（100×103U/L）、链霉素（100×103U/L），培养箱中37℃，50mL/L CO2常规培养，次日更换培养液继续培养。选择3～6代细胞用于实验。将对数生长期的细胞按5×108个/mL密度接种于预置有盖玻片（8mm×8mm）的24孔板中，接种24h后更换培养液，每孔加入2mL培养液。实验分两组，第1组加入DMEM培养液，第2组加入加有100mL/L新生牛血清的DMEM培养液。分别向2组细胞中加入硅油含量为0（10mmol/L PBS液，空白对照），12.5,25.0,50.0mL/L的染色乳化硅油液100μL，常规培养24h，取出爬片，10mmol/L PBS液充分冲洗3次，40g/L多聚甲醛固定0.5h，用吸管吸取多聚甲醛轻轻冲洗爬片上残留硅油小滴3次，10mmol/L PBS液漂洗3次，待测。光学显微镜下观察，每张爬片随机取3个视野，每个视野至少计数50个细胞，用图象采集分析系统(Image－Pro Plus 6.0)计算细胞内吞的染色硅油小滴来分析RPE细胞对硅油小滴的吞噬作用。每个浓度设3个复孔，重复实验3次。

    统计学处理：采用数据软件SPSS11.5处理，采用t检验，进行两样本均数比较，以及LSD 检验，进行多组样本均数比较，数据表示为 。

    2结果

    用孔径为0.45μm的微孔膜制得的硅油小滴直径为4.25±0.77μm，硅油小滴可稳定至少5d。酞箐蓝可均匀着染硅油小滴，不溶于PBS，可示踪硅油小滴，分析RPE细胞内吞硅油小滴的情况。培养的RPE细胞固定于玻璃面上，在DMEM组与加有100mL/L新生牛血清的DMEM组中，空白对照中的细胞内均未见硅油小滴。与酞箐蓝标记的硅油小滴共孵育的RPE细胞对此物质有吞噬作用。RPE细胞对硅油小滴的吞噬作用呈浓度依赖性。在DMEM组中，RPE细胞内吞硅油小滴的平均数量随硅油浓度的递增而增加（各组间均为P <0.001），并没有呈现明显吞噬饱和状态。硅油浓度为50.0mL/L时，RPE细胞内吞硅油小滴数量为35.93±3.28（图1）。在加有100mL/L新生牛血清的DMEM组中，RPE细胞内吞硅油小滴的平均数量也随硅油浓度的递增而增加（各组间均为P <0.001），也没有呈现明显吞噬饱和状态。硅油浓度为50.0mL/L时，RPE细胞内吞硅油小滴数量为40.27±4.34（图1），多于同一硅油浓度的DMEM组（P <0.05）。DMEM组中各组硅油浓度的RPE细胞内吞硅油小滴数量和加有100mL/L新生牛血清的DMEM组同一浓度的RPE细胞内吞硅油小滴数量之间有明显差异（P <0.05），说明加有血清的硅油小滴使RPE细胞的吞噬能力进一步增强，血清在这一吞噬过程中起促进作用(图2A,B)。

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