3讨论

    以往实验表明眼球振动、纤维素、白蛋白、血影细胞等加速硅油乳化，但都是使用低粘度硅油，这些因素对高粘度硅油的乳化没有显著作用[2]。工业传统乳化方法耗能高，微粒大小不易控制，用来模拟人眼内乳化硅油模型不理想。膜乳化法是指分散相受压后通过微孔膜，自发形成单分散性乳化液。此种方法能量消耗低、微粒直径和微粒分散性可控和只需低切应力。微孔膜最大优点是孔径均一，能制备单分散乳化液[3]。我们采用微孔膜膜乳化法制备乳化硅油，不需加入其他乳化剂，有利于研究纯硅油小滴对RPE细胞吞噬活性的影响。使硅油在1个大气压下通过孔径为0.45μm的微孔膜制得的小滴直径为4.25±0.77μm，制得硅油小滴至少可以稳定5d。使用酞箐蓝染料标记硅油小滴。酞箐蓝染料是一种化学性质非常稳定的化合物，对光、热、酸、碱呈高度稳定性，由于其在一定条件下对细胞产生光毒性作用，近年来用于光动力治疗肿瘤等疾病。Glassberg等[4]报道酞箐类染料在缺乏激光激发以及浓度低于25mg/L时，对细胞没有毒性作用。用来标记硅油，对细胞活力、发育或基本生理特性不会有影响。由于酞箐蓝是油溶性染料，不溶于水，可认为染料对硅油标记有特异性。比较不同组RPE细胞内吞标记的硅油小滴数量来研究不同因素对RPE细胞吞噬活性的影响。

    RPE细胞具有多种复杂的生化功能。吞噬消化光感受器外节脱落的膜盘，对外节的更新和光感受器的存活至关重要[5]，是其重要的功能之一。这种选择性吞噬作用称为特异性吞噬。此外， RPE细胞还具有非特异性吞噬功能，即能吞噬无特异性辨别位点的物质，如聚乙烯微球、胎盘兰染料、黑色素小滴等。非特异性吞噬与RPE细胞膜上的慢速摄取受体有关[6,7]。细胞骨架在RPE细胞非特异吞噬时起一定作用。其中肌动蛋白有助于RPE对异物的摄取；内吞物在RPE细胞内移动至初级溶酶体有赖于微管的参与[8]。在长期硅油填充的患眼中，RPE细胞与硅油小滴接触，非特异性识别、并吞噬，可能引起一系列RPE细胞生物学行为的改变。我们在体外用RPE细胞与硅油小滴共孵育，观察细胞吞噬硅油小滴，结果显示RPE细胞有较强的吞噬活性。我们用乳化硅油液与RPE细胞共孵育，RPE细胞内吞硅油小滴的数量随硅油浓度递增而增加，并且没有显示明显的饱和状态，可能与实验选用乳化硅油浓度稍低有关。另外，如选用纯的PBS液作为对照组，并未加入其他RPE细胞可识别、吞噬的物质，因此，与其他物质相比，硅油小滴能否增强RPE细胞的吞噬能力，以及其他物质刺激RPE细胞吞噬是否呈浓度依赖性，还需进一步实验证明。

    血清能刺激RPE细胞的吞噬活性。Mayerson等[9]的研究显示，在RPE吞噬过程中，识别和摄取是高度特异化的过程，血清在吞噬过程中至关重要。在比较RPE细胞和巨噬细胞的吞噬机制时，Irschick等[10]发现血清能适度的增加RPE细胞对细菌的吞噬。这种刺激作用可能与血清中含有多种活性因子有关。Miceli等[11]报道，在血清刺激RPE 细胞吞噬外节时，玻璃体结合蛋白起一定作用。Hall等[12]认为RPE细胞的吞噬作用需要血清的存在。而血清中的Gas6，一种维生素K依赖的血清蛋白，在此过程中可以完全替代血清。同时还发现蛋白质S，也是维生素K依赖的血清蛋白，与Gas6结构高度相似，在血液中的作用与Gas6相似。此外，Edwards[13]发现，血清刺激RPE细胞吞噬作用仅发生在RPE细胞顶端。因此，在炎症、外伤或其他视网膜疾病情况下，血浆外渗使RPE暴露在血清中，刺激吞噬活性。本实验结果表明，用微孔膜制备乳化硅油液，能够很好的模拟人眼内硅油乳化的情况。RPE细胞对硅油小滴的吞噬呈浓度依赖性，此过程中血清可能刺激RPE细胞对硅油小滴的吞噬。

   【参考文献】

1张少冲,李松峰,刘恬,乔利亚.硅油长期充填眼部改变及取出原因和结果.中国实用眼科杂志, 2004;22:269-271

2马丽娜,惠延年.乳化硅油及其并发症.国际眼科纵览,2006;30:42-45

3 van-der-Graaf S, Schroen CG, van-der-Sman RG, Boom RM. Influence of dynamic interfacial tension on droplet formation during membrane emulsification. J Colloid Interface Sci ,2004;277(2): 456-463

4 Glassberg E, Lewandowski L, Lask G, Uitto J. Laser-induced photodynamic therapy with aluminum phthalocyanine tetrasulfonate as the photosensitizer: differential phototoxicity in normal and malignant human cells in vitro. J Invest Dermatol ,1990; 94(5): 604-610

5 Hoppe G, O'Neil J, Hoff HF, Sears J. Products of lipid peroxidation induce missorting of the principal lysosomal protease in retinal pigment epithelium. Biochim Biophys Acta ,2004;1689(1):33-41

6孙昱昭,洪晶.双重荧光标记法检测人视网膜色素上皮细胞吞噬的功能.国际眼科杂志,2006;6(1):42-46

7张鲲,何守志.bFGF对体外培养牛RPE细胞特异性吞噬功能的影响.国际眼科杂志,2006;6(1):72-74

8李红艳, 朱秀安.视网膜色素上皮吞噬机理的研究进展.国外医学眼科学分册,1994;18(2):86-90

9 Mayerson PL, Hall MO. Rat retinal pigment epithelial cells show specificity of phagocytosis in vitro. J Cell Biol ,1986;103(1):299-308

10 Irschick EU, Sgonc R, Bock G, Wolf H, Fuchs D, Nussbaumer W, Gottinger W, Huemer HP. Retinal pigment epithelial phagocytosis and metabolism differ from those of macrophages. Ophthalmic Res ,2004;36(4):200-210

11 Miceli MV, Newsome DA, Tate DJ. Vitronectin is responsible for serum-stimulated uptake of rod outer segments by cultured retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1997;38(8):1588-1597

12 Hall MO, Obin MS, Heeb MJ, Burgess BL, Abrams TA. Both protein S and Gas6 stimulate outer segment phagocytosis by cultured rat retinal pigment epithelial cells. Exp Eye Res ,2005;81(5):581-591

13 Edwards RB. Stimulation of rod outer segment phagocytosis by serum occurs only at the RPE apical surface. Exp Eye Res ,1991;53(2):229-232

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