【摘要】目的：探讨细胞间隙连接蛋白connexin43（Cx43）在BN大鼠视网膜中的分布特点。 方法：以雄性挪威棕色大鼠（Brown Norway）为研究对象，应用免疫组化方法观察Cx43在BN大鼠视网膜中的分布特点。 结果：正常视网膜内界膜，视神经纤维层以及神经节细胞层明显表达，神经节细胞表达的主要位置是细胞质和细胞膜，色素上皮细胞全层表达，内外颗粒层及内外层状层无表达。结论：正常视网膜的Cx43主要分布在内界膜，神经纤维层，视网膜节细胞层和视网膜色素上皮层。

   【关键词】  BN大鼠　视网膜　缝隙连接　连接蛋白Cx43

　　 Gap junction protein connexin43 expressed in the BN rat retina

    Qiu-Li Liang, Feng-Xiang Wang, Shou-Zhi He, Xue-Hui Shi, Bing Chen

    Foundation item: Natural Science Foundation of Beijing City,China(No.7032046)

    Department of Ophthalmology, China PLA General Hospital, Beijing 100853, China

    Abstract AIM：To investigate the express of the gap junction protein connexin43（Cx43）in the BN rat retina. METHODS：Immunohistochemical distribution of connexin43（Cx43） in the retina of the BN rats was investigated. RESULTS：In BN rat retina，Cx43 was immunolocalized to internal limiting membrane，nerve fiber layer，ganglion cell layer and pigment epithelium.Cx43 appeared in the form of distinct puncta distributed on ganglion cell. CONCLUSION：The distribution of Cx43 in the normal retina is internal limiting membrane，nerve fiber layer，ganglion cell layer and pigment epithelium。

    · KEYWORDS：BN rat; retina; gap junction; connexin43

　　0引言

    缝隙连接（Gap junction）是细胞间相互连接的一种主要方式，其主要功能是介导细胞和细胞之间的信息传递，缝隙连接由相邻细胞膜上2个连接子相连而成，而每个连接又由6个蛋白亚单位-连接蛋白（connexin， Cx）构成。缝隙连接分布于全身各个组织器官，负责细胞间功能和代谢的协调，该通道的功能主要是允许小分子物质自由通过，包括离子，代谢产物，以及一些第二信使（cAMP，Ca2+，IP3）及其它参与细胞生长分化的调节性物质，通过物质的交换构成细胞间的缝隙连接通讯（gap junction intercellular communication, GJIC）。目前的研究表明，在许多正常动物的视网膜各层中均发现缝隙连接蛋白的表达，各种动物视网膜表达不同种类的连接蛋白，而且视网膜各层表达的连接蛋白也因动物种属不同而不同，但是在缝隙连接蛋白大家族中以Cx43在视网膜中表达最为丰富[1-5]，总体来说对于正常动物视网膜中连接蛋白的表达已有许多研究，但是对于损伤修复过程中，连接蛋白的分布位置及表达的变化研究较少，我们对正常大鼠视网膜中的Cx43进行免疫组化的观察，以了解其种属的特异性分布，并初步探讨其意义。

    1材料和方法

    1.1材料 以成年雄性挪威棕色大鼠（解放军总医院实验室提供）为实验材料，过量麻醉处死，摘除眼球，于角膜缘后0.5mm处剪开眼球壁，去除眼前节和玻璃体，余下的眼杯用多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡后常规石蜡包埋，5μm厚度连续切片，做免疫组织化学检测。

    1.2方法 一抗为兔抗鼠Cx43相关抗原mAb单克隆抗体（工作浓度为1∶100，武汉博士德公司），二抗生物素化羊抗兔IgG，SABC试剂盒及DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。实验步骤按试剂盒说明书进行，采用免疫组化SABC法染色，DAB显色，经苏木素复染后封片。实验中分别用0.01mol/L的PBS 取代一抗孵育，作为阴性对照，已知鼠心肌阳性切片作为阳性对照。结果：以深棕黄色颗粒为阳性，稀疏，散在的棕黄色颗粒为弱阳性，无棕黄色颗粒为阴性。

    2结果

    正常视网膜的内界膜，神经纤维层，神经节细胞层Cx43明显表达，神经节细胞表达的主要在细胞质和细胞膜，呈斑点状染色，色素上皮细胞表达较为强烈，呈全层表达，而内外颗粒层及内外层状层无表达（图1A），阴性对照组无表达（图1B）。

    图1 正常视网膜Cx43的表达（SABC 10×20） A：阴性对照；B：阴性对照组未表达

    3讨论

    自从对脊椎动物视网膜中的第一个缝隙连接蛋白—金鱼CX35的表达进行研究后，研究者们对视网膜各层的缝隙连接蛋白进行了大量的研究，结果表明，在视网膜不同细胞中之间发现多种缝隙连接蛋白的表达，诸如Cx26，Cx31，Cx32，Cx36，Cx37，Cx40，Cx43，Cx45，and Cx50等[2-6]，但是其中以Cx43表达较为丰富而且研究最多，例如Cx43在兔视网膜主要分布在不同种类的胶质细胞中，最明显表达部位是星形胶质细胞和Müller细胞。同时Cx43也可在少突细胞中表现为点状表达[3]，小鼠的神经纤维层有表达，鱼的视网膜外界膜、Müller细胞、内外网质层有表达[4]，鲶鱼视网膜中Cx43主要表达在内界膜和外核层[5]，众多的研究结果表明，缝隙连接构成视网膜的重要功能单位，特别是在兴奋型细胞中，缝隙连接具有传导快、阻抗低，延搁时间短的特点，参与细胞间活动的协调及信息的传递和神经脉冲的传导，使得组织中不同细胞能保持协调的细胞代谢及生理功能。Cx43不但对于视网膜的正常生理功能非常重要，并且还与细胞的分化及生长发育有关[7]。尤其重要的是缝隙连接蛋白一方面对于控制视网膜细胞增殖起控制作用，另一方面缝隙连接蛋白Cx43的表达与眼胚胎的发育，控制早期视网膜的神经发育有关，并且和成年以后的视网膜的再生有密切的联系[8-11]。我们的观察对象是成年BN大鼠，结果表明，BN大鼠视网膜Cx43表达部位与上述动物表达的部位不完全相同，它主要表达部位是内界膜，视网膜神经纤维层，视网膜神经节细胞明显表达，蛋白表达的主要位置在细胞质和细胞膜，色素上皮细胞全层表达，内外颗粒层及内外层状层无表达。内外网质层无表达，因此，BN大鼠与小鼠有部分的相似性，但是其他脊椎动物相比，表达部位有其特殊性。

   【参考文献】

1 Deans MR, Paul DL. Mouse hotizontal cells do not express connexin26 or connexin 36. Cell Commun Adhes ,2001;8(4-6):361-366

2 Guldenagel M, Sohl G, Plum A, Traub O，Teubner B, Weiler R, Willecke K. Expression patterns of commexin genes in mouse retina. J Comp Neurol ,2000;18;425(2):193-201

3 johansson K, Bruun A, Ehinger B. Gap junction protein commexin43 is heterogeneonsly expressed among glial cells in the adult rabbit retina. J Comp Neurol ,1999;10;407(3):395-403

4 Janssen Bienhoid U, Dermietzel R, Weiler R. Distribution of connexin43 immunoreactivity in the retinas of different vertebrates. J Comp Neurol ,1998;6;396(3):310-321

5 Wang FX, He SZ, Gu Z, Liang QL, Chen B. Effect of epidermal growth factor on the expression of Cx43mRNA of human retina pigment epithelium cells. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) ,2006;6(1):57-60

6 Giblin LJ, Christensen BN. Connesin 43 immunoreactivity in the catfish retina. Brain Res ,1997;25;755(1):146-150

7 Vaney DI, Weiler R. Gap junction in the eye: evidence for heteromeric, heterotypic and mixed-homotypic interactions. Brain Res Review ,2000;32;115-120

8 Becker D, Ciantar D, Catsicas M, Pearson R, Mobbs P. Use of PIRES vectors to express EGFP and commexin constructs in studies of the role of gap junctional communication in the early development of the chick retina and brain. Cell Commun Adhes ,2001;8(-6):355-359

9 Umino Y, Saito T. Spatial and temporal patterns of distribution of the gap junctional protein connexin43 during retinal regeneration of adult newt. J Comp Neurol ,2002;16;454(3):255-262

10 Becker David L, Bonness Viola, Catsicas Marina, Mobbs Peter. Changing patterns of ganglion cell coupling and connexin expression during chick retinal development. J Neurobiol ,2002;15;52(4):280-293

11 Becker DL, Mobbs P. Connexin alphal and cell proliferation in the developing chick retina. Exp Neurol ,1999;156(2):326-332