【摘要】目的: 探讨高糖培养牛视网膜微血管周细胞FOXO1A表达。方法: 原代培养周细胞，用免疫细胞化学和Western blot方法检测高糖诱导的牛视网膜微血管周细胞FOXO1A蛋白表达。结果：视网膜微血管周细胞在5mmol/L D-葡萄糖培养72h后，FOXO1A免疫反应性主要表现在细胞核，在30mmol/L D-葡萄糖或5μ mol/L H2O2培养72h后，FOXO1A免疫反应性显着增加，FOXO1A免疫反应性主要表现在细胞核和细胞质；Western blot发现高糖组和过氧化氢组周细胞培养48,72h后FOXO1A蛋白活性和表达较对照组显着增加。结论：高糖诱导的视网膜微血管周细胞FOXO1A表达和活性显著增加。

   【关键词】  周细胞　葡萄糖　FOXO1A　蛋白表达

　　Up-expression of FOXO1A in bovine retinal microvascular pericytes induced by glucose

    Yang-Jun Li, Yan-Nian Hui

    Department of Ophthalmology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China

   Abstract  AIM: To study the expression of FOXO1A in bovine retinal microvascular pericytes cultured with the high glucose medium. METHODS: Primary bovine retinal microvascular pericytes were cultured. FOXO1A expression was measured in bovine retinal microvascular pericytes treated with low glucose (5 mmol/L), high glucose (30mmol/L) and H2O2 (5μmol/L) in medium containing 20mL/L fetal bovine serum using immunocytochemistry and Western Blot analysis.RESULTS: Slight FOXO1A immunoreactivity was detected the retinal microvascular pericytes treated with low glucose after 72 hours distributed in the nucleus. FOXO1A immunoreactivity was significantly increased in the retinal microvascular pericytes treated with high glucose and H2O2 after 72 hours and distributed in the nucleus and cytoplasm of pericytes. Western Blot showed that FOXO1A protein expression levels increased in high glucose and H2O2 groups after 48 hours, 72 hours compared with that in low high group and phosphor-FOXO1A protein expression levels reduced after 48 hours, 72 hours compared with that in low high group.
 CONCLUSION: These data show that high glucose induced the over-expression of FOXO1A in the retinal microvascular pericytes.

    · KEYWORDS: pericyte; glucose; FOXO1A; protein expression

　　0引言

    糖尿病视网膜病变是糖尿病视力损害的长期严重的并发症，特征性的改变是视网膜微血管功能的异常。其早期的标志是视网膜微血管周细胞的丧失，而且周细胞的永久性丧失是糖尿病视网膜病变的原发性损害。由于周细胞在成人视网膜不能复制，周细胞的丧失导致视网膜病理改变的发展包括渗透性增加、基底膜增厚、微动脉瘤形成、内皮细胞增殖和新生血管，最终导致失明[1]。然而目前有关周细胞丧失的详细机制仍然不清楚。细胞的凋亡要受到细胞内各种分子的调控， Fox（forkhead）蛋白家族是2000年正式发布统一命名的在进化上具有一个螺旋-转角-螺旋基序，3α螺旋和2 个大环形成翼状(winged) 结构保守氨基酸序列的DNA 结合结构域的一种转录因子[2]，其中FOXO转录因子亚家族包括FOXO1A，FOXO3，FOXO4，FOXO6等，主要通过转录调控和信号传导途径在动物的生长发育、细胞分化、代谢、凋亡、炎症和免疫等方面起重要作用[3].因此探讨FOXO1A在糖尿病视网膜中的作用有助于进一步了解糖尿病视网膜病变的发病机制。

    1材料和方法

    1.1材料 DMEM培养基、胎牛血清( FBS)、胰蛋白酶、依地酸购于美国Gibco公司；DAB显色剂、胶原酶Ⅰ购于美国Sigma公司；α平滑肌肌动蛋白mAb、von Willebrand 因子多克隆抗体，FITC标记羊抗兔IgG ，Western Blotting 化学法光试剂购于美国Santa Cruz 生物技术公司；FOXO1A购买于英国Abcam公司；免疫组化试剂盒购于美国Vector 实验室； Phospho-FOXO1A抗体购买于Cell Signaling生物技术公司。新鲜牛眼球从本地屠宰场获取,冰上运输到实验室,4h内处理。剪除眼球外组织, 浸入复方碘溶液10min，用含100kU/L青链霉素的PBS反复冲洗。去眼前段组织及玻璃体，分离取出视网膜神经层，置于含有100kU/L青链霉素的DMEM中，剪碎至糊状，过100μm滤网, 然后翻转滤网，DMEM冲洗收集洗脱液。800r/min 4℃离心5min。吸除DMEM,加入3倍体积625kU/LⅠ型胶原酶溶液，37℃孵育10min后终止，过88μｍ滤网,收集网下洗脱单细胞悬液。800r/min 4℃离心5min后弃上清。取离心后的底部组织加入含200mL/L FBS的DMEM，50mL/L CO2 37℃孵箱中培养,48h后更换培养液。每3～4d用细胞刮子将不需要的细胞刮除。待细胞近融合时用0.25g/L胰蛋白酶液消化传代，以1∶2接种在新的培养瓶内。传代后取第1代细胞以5×105个细胞/孔接种于预置有用L-多聚赖氨酸包被的盖玻片的24孔培养板内, 含200mL/L FBS的DMEM培养近80%时，40mL/L多聚甲醛固定细胞30min, α平滑肌肌动蛋白抗体免疫荧光法及von Willebrand因子抗体免疫细胞化学鉴定周细胞。

    1.2方法

    1.2.1免疫荧光染色鉴定周细胞　 在培养板中预置L-多聚赖氨酸包被的盖玻片,待细胞生长接近融合时取出, 200mL/L多聚甲醛固定细胞30min, 各组周细胞爬片充分水化，2mL/L TritonX-100作用10min; PBS冲洗后，30mL/L H2O2溶液抑制内源性过氧化物酶,室温下放置10min;PBS冲洗后，50mL/L正常血清封闭30min,倾去血清,滴加一抗1∶200兔抗鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mAb,阴性对照组加0.01mol/L pH值7.2 PBS,4℃过夜; PBS冲洗后，滴加二抗为羊抗兔1∶100 IgG-异硫氰酸荧光黄(FITC)室温避光孵育30min; PBS冲洗后荧光显微镜观察,细胞发出绿色荧光为阳性。兔抗鼠von Willebrand因子抗体行免疫细胞化学,方法同下。

    1.2.2 免疫细胞化学分析 传代后取第1代细胞以5×105个细胞/孔接种于预置有L-多聚赖氨酸包被的盖玻片的24孔培养板内，于浓度5.5mmol/L葡萄糖（对照组）、30mmol/L葡萄糖(高糖组)、5μmol/L H2O2和30mmol/L甘露醇组（24.5mmol/L+5.5mmol/L葡萄糖）含20mL/L FBS的DMEM培养基中培养72h后，40g/L多聚甲醛固定细胞30min，各组周细胞爬片充分水化,PBS冲洗，2mL/L TritonX-100作用10min，PBS冲洗；30mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶活性10min后PBS冲洗。正常羊血清封闭30min，倾去多余血清,滴加一抗为1∶200兔抗FOXO1A多克隆抗体，阴性对照组加0.01mol/L pH值7.2的PBS，未加一抗，4℃过夜，PBS冲洗，滴加1∶1 000生物素化的羊抗兔二抗30min，PBS冲洗，滴加辣根过氧化酶结合的卵白素30min，PBS冲洗后，DAB显色。常规酒精脱水，二甲苯透明后封片。

    1.2.3 Western blot分析 传1代的视网膜微血管周细胞分别培养于5.5mmol/L（对照组）、30mmol/L(高糖组)葡萄糖和30mmol/L甘露醇组（24.5mmol/L+5.5mmol/L葡萄糖）的含20mL/L FBS的DMEM培养液中培养24,48,72h，以便于下步实验。周细胞孵育规定时间后，用冰PBS冲洗后，细胞培养瓶内加入适量细胞裂解液(20mmol/L Tris-HCl, pH 7.5; 150mmol/L NaCl; 10ml/L Triton X-100; 1mmol/L EDTA; 1mmol/L EGTA; 1mmol/L PMSF; 250mmol/L Na4P2O7; 1mmol/L NaF; 1mmol/L Na3VO4)收集，180W，6min，0℃超声波破碎，5 000r/min，离心5min，取上清，Bradford法测定蛋白浓度。等量的蛋白各25μg，用2倍浓度的等体积蛋白上样缓冲液，100°C加热5min，使蛋白充分变性，冷却到室温，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内。在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，用三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸-甲醇缓冲液将蛋白电转移到硝基纤维膜上1～1.5h后，用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。转膜完成后，在Western洗涤液中漂洗2min，吸尽洗涤液后，加入含50g/L的乳脂粉0.5g/L Tween-20的PBS封闭液在摇床上室温封闭1h。吸尽封闭液，加入1∶1 000的兔抗FOXO1A或1∶1 000的兔Phospho-FOXO1A一抗，4℃孵化过夜，膜用Western洗涤液在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10min。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤10min。共洗涤3次。滴加1∶1 000辣根过氧化物酶结合的羊抗兔IgG二抗，室温2h。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤10min。共洗涤3次。将所得的阳性条带进行光密度测定，用增强的化学发光试剂盒分析，光密度面积计算FOXO1A或Phospho-FOXO1A蛋白含量。

    统计学分析：所有实验数据用 表示，用SPSS 10.31统计分析软件，两组均数比较用t检验，P <0.05认为有显著差别。

    2结果

    2.1牛视网膜微血管周细胞形态 周细胞呈贴壁生长, 培养3～5d 后, 可见周细胞生长, 自然分开并呈不规则状、细胞体肥大伸出较多突起，生长缓慢, 可呈现出非接触抑制的重叠状生长。原代培养14d 左右细胞达到融合, 传代培养周期为6～7d(图1A，B)。α-SMA 荧光染色的阳性, 阳性率达95% 以上(图1C)。von Willebrand因子抗体免疫细胞化学染色呈阴性(图未显示)。

    2.2高糖诱导牛视网膜周细胞FOXO1A表达上调 分别在不同条件下培养的牛视网膜微血管周细胞，FOXO1A蛋白的表达不同。在浓度为5.5mmol/L葡萄糖和浓度为30mmol/L 甘露醇（24.5mmol/L+5.5mmol/L葡萄糖）条件下培养72h，周细胞FOXO1A阳性表达分布在细胞核（图2A）；浓度为30mmol/L葡萄糖5μmol/L过氧化氢下培养72 h，FOXO1A在周细胞的细胞核和细胞质表达显着增加，呈棕色（图2B，C）。阴性对照组无表达（图未显示）。

    2.3 高糖诱导的视网膜微血管周细胞FOXO1A和p-FOXO1A蛋白表达 为了进一步证明不同浓度的葡萄糖在不同时间对视网膜微血管周细胞FOXO1A和phospho-FOXO1A蛋白量的影响，我们行Western blot分析，周细胞在浓度为5.5mmol/L，30mmol/L葡萄糖和30mmol/L甘露醇的含20mL/L FBS的DMEM培养液中培养24，48，72h。Western blot发现在培养24h后，高糖组FOXO1A和phospho-FOXO1A的蛋白水平分别减少17%和增加40%与对照组相比，培养48h和72h后高糖组FOXO1A和phospho-FOXO1A的蛋白水平分别增加45%，51%和减少44%，63%与对照组相比。而甘露醇组与对照组无差别（图3）。

    图 1 牛视网膜微血管周细胞倒置相差显微镜像，周细胞形态不规则, 伸出较多突起。 A：周细胞传代第4d×400；B：周细胞传代融合期×200; C：周细胞α-SMA FITC×400

    图 2 牛视网膜微血管周细胞FOXO1A免疫细胞化学分析×200 A：低糖组周细胞弱阳性；B和C：高糖组和过氧化氢组阳性

    图 3 牛视网膜微血管周细胞FOXO1A和phospho-FOXO1A 蛋白免疫印迹分析 N，D1，D2，D3，M：对照组、高糖条件下培养24，48，72h和甘露醇组，β-actin 为内参照。上图免疫印迹法分析不同培养基周细胞FOXO1A蛋白水平，条带的分子量为70kDa；下图免疫印迹法分析不同培养基周细胞phospho-FOXO1A蛋白水平，条带的分子量为82kDa。aP＜0.05 vs对照组

[1] [2] 下一页