【摘要】目的：探讨单纯去细胞猪角膜基质材料诱导兔自体角膜细胞再生及修复兔角膜溃疡的可行性。方法：新西兰白兔10只制作成角膜溃疡模型，接受单纯去细胞猪角膜材料的穿透性角膜移植术，排除发生手术并发症眼(2只),剩余8只术后进行大体观察(裂隙灯检查)，观察植片透明度、新生血管、上皮修复情况。分别于3, 6, 8, 16 和24wk取材进行组织学观察，并取16wk兔行超声生物显微镜（UBM）检查、32wk兔行透射电镜检查。结果：角膜溃疡修复，眼表重建8只。初期角膜上皮反复糜烂，荧光素纳染色有荧光堆积，HE组织学检查提示4wk时上皮细胞复层化。角膜基质细胞沿材料板层生长，排列规律；3～7d角膜缘新生血管发生，位于浅基质层，1～20d达高峰，深入植片或沿缝线环形生长，拆线后逐渐消退，32wk后闭锁仅余3～4支微血管；UBM提示角膜恢复自然曲率，植床与植片尚未修复完善。TEM提示成纤维细胞分泌胶原原纤维，参与材料改建。结论：CACM支持细胞3D生长，促进自体细胞长入，参与角膜修复改建。

   【关键词】  组织工程　角膜　支架材料　去细胞处理

　　Penetrating keratoplasty with plain porcine cornea acellular matrix in rabbit keratohelcosis

    Hao Meng1, Yan-Nian Hui1, Xu-Chu Lin1, Wei Lu2, Jun Fang2, Yan Jin2

    Foundation item: Special Foundation in Tissue and Organ Project of 863 Program, China (No. 2002AA205041, 2005AA205241)

    1Department of Ophthalmology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China;2 Research and Development Center for Tissue Engineering, Department of Oral Histology and Pathology, College of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China.

    AbstractAIM:To evaluate the function, morphological changes and cellular composition of cornea acellular matrix (CACM) after penetrating keratoplasty (PKP) in rabbit cornea ulcer models for 3-36 weeks. METHODS:Ten rabbit corneal ulcer models were prepared 1 week before operation and all received PKP with plain CACM. The rabbits with postoperative complications such as secondary glaucoma and hyphema were excluded (n=2). The left corneal grafts were analyzed by slit lamp, ultrasound sound microscopy, transmission electron microscopy and light microscopy.RESULTS: Autologous cells reseeding was found in every case. The reconstructed ocular surface showed uneven and irregular fluorescein staining absent of epithelial defects during 1-2 weeks, and the defects were gradually reepithelialized from the surrounding epithelium. HE staining showed that epithelial cells were confluent and stratified after 4 weeks of operation. Keratocytes migrated into CACM along the collagen layers and secreted collagen fibril (TEM). Corneal neovascularization (CNV) occurred at day 4-7, fibrovascular pannus grew over the cornea grafts ta day 14-20 and minimized till week 32. The cornea grafts became nearly transparent with normal shape.CONCLUSION: CACM can support the 3D growth of corneal cells in vivo and rebuild ocular surface with autologous corneal cells regeneration.

    · KEYWORDS: tissue engineering; cornea; acellular matrix; cell extraction

　　 0引言

    角膜病是我国第2大致盲眼病，有效的治疗方法是穿透性角膜移植术[1]。随着艾滋病、传染型肝炎、克—雅（Creutzfeldt-Jakob）氏病等传染病以及接受角膜屈光手术者增多等原因造成了角膜供体材料匮乏。解决的关键是利用人工角膜替代物，其中组织工程角膜是最佳的选择。国内外多用生物材料、高分子材料或二者的混合物为支架材料构建角膜等效物，可塑形，透明度高[2]，缺点是韧性较差，代谢产物影响细胞生长，不适于穿透性角膜移植术。国内学者使用冻干去细胞猪角膜基质（CACM）作为组织工程角膜的支架材料，研究发现，其体外组织相容性良好[3,4]，我们通过观察兔自体角膜细胞在CACM上的生长情况，进一步探讨APCM的在体生物相容性、韧性及其改建特性，为构建组织工程角膜打下基础。

    1材料和方法

    1.1材料 市售新鲜猪眼，以自动板层角膜刀制作200μm角膜瓣，取包含后弹力层的角膜基质，标记DM面，按参考文献[3]方法进行去细胞处理后，DM面向上，37℃恒温箱晾干，冷冻干燥机内冻干，独立封装，Co60照射灭菌，4℃保存备用。另将新鲜全层猪角膜置于0.1mmol/L盐酸内10min，取出修剪成直径4mm圆片，晾干备用。雄性新西兰大白兔(2～2.5kg) 10只，右眼为实验眼，术前检查均无眼部病变。速眠新Ⅱ号0.2 mL/kg im，10g/L丁卡因眼液点眼，于兔眼中央制作直径4mm、约1/3角膜厚的圆形角膜基质囊袋，将备好酸处理材料塞入，10-0尼龙缝线缝合囊袋口2针，术毕结膜囊内涂红霉素眼膏，制作无菌性角膜溃疡。

    1.2穿透性角膜移植术 美多丽眼液点溃疡眼，1次/5min，共3次，速眠新Ⅱ号0.2 mL/kg im，10g/L丁卡因眼液点眼，开睑器开睑，上下直肌缝线牵引固定，做包含全部溃疡灶、直径7mm圆形植床，前房内滴1∶12 500肝素钠注射液1滴，将无血清DF-12培养基浸泡12h的去细胞猪角膜材料取出，以角膜环钻钻取直径7.5mm的圆形CACM植片，DM面向外，原位间断缝合16～17针，透明质酸钠形成前房，术毕结膜下注射地塞米松、庆大霉素，结膜囊内涂红霉素眼膏。1例术后长期浅前房，虹膜前粘连，继发青光眼， 1例术中虹膜脱出，虹膜嵌顿于创口，反复还纳后造成出血，均排除。术后给予庆大霉素1万U、地塞米松1mg结膜下注射，隔日1次，共3次，红霉素眼膏点眼每日2次，复方托品酰胺点眼每日2次治疗。术后2wk内每日进行大体观察(裂隙灯检查)，主要观察指标：新生血管出现时间，新生血管的数量、长度；植床有无水肿，有无缝线反应；植片透明度、表层材料有无自溶，角膜上皮修复情况（荧光素纳染色）；之后每周观察2次，发现缝线松脱则随时拆除；常规术后6wk间断拆除缝线，16wk时做超声生物显微镜（UBM）检查。分别于术后3, 6, 8, 16 和24wk过量5g/L戊巴比妥钠注射液iv处死取材，4g/L多聚甲醛液固定，作HE组织切片，光学显微镜观察；取32wk兔进行TEM检查；保留2只动物未取材，长期观测植片透明度恢复情况。

    2结果

    去细胞过程能够去除角膜基质内所有细胞成分，对胶原纤维排列干扰较小。通过密闭容器静置存放12h，可以清除材料内出现的细小气泡；确保晾干处理后CACM透明，韧性强。晾干材料缺乏角膜自然曲率,扁平（图1A）；复水后透明度略下降(图1B)，表现为A值增加（图2）；HE染色可见胶原纤维排列整齐，后弹力层完整，无细胞成分（图1C）。酸处理后的全层猪角膜材料硬韧，PH值低，未进行灭菌处理，植入角膜层间后因吸收水分出现膨胀，加之酸的化学作用，角膜瓣很快出现水肿、融解，猪角膜被排出，周边角膜基质灰白水肿，后弹力层膨出，菲薄，轻微外力可以造成穿孔（图3A）。选择后弹力层膨出接近穿孔时施行穿透性角膜移植术。

    穿透性角膜移植术后当时植床水肿，植片较平坦，曲率欠佳（图3B），4d角膜缘充血，7d出现密集新生血管，主要位于1∶00和7∶00钟位，14～20d达高峰，浅层新生血管到达角膜缝线处，分成多个细小分支进入植片，或者沿植片植床间隙生长。间断拆除缝线后，新生血管大部分消退，粗大血管变细、闭锁。14d时植片中央仅见点状荧光素钠着色，角膜上皮无水肿（图3C）。12wk时角膜曲率恢复，与对侧相同，32wk时大部分新生血管闭锁，植片逐渐透明，瞳孔及虹膜纹理清晰（图3D）。术后16wkUBM检查提示，上皮层修复完善，基质回声粗糙，后弹力层面不平滑，植片与植床连接处角形隆起（图3E）。兔角膜上皮的基底细胞与材料的DM牢固结合,上皮细胞复层化，为3～5层，基底细胞、翼状细胞形态稍大，未见异常增生（图4A）。基质细胞转化为纤维母细胞，最先出现于与接近角膜上皮层部位，沿CACM浅表胶原板层移行，1～2wk后深层胶原内有移行的纤维母细胞出现；新生血管位于浅层（图4B），血管周围有少量淋巴细胞聚集。 成纤维细胞分泌胶原原纤维，混杂于CACM胶原之间（图4C），新老胶原混杂，新生胶原排列欠规整，支架胶原排列规则。

    图 1 晾干去细胞猪角膜材料 A：复水前；B：复水后；C：HE去细胞彻底，后弹力层保留×200

    图 2 晾干材料复水后透光度下降

    图 3 角膜溃疡穿透性移植术后观察 A：角膜溃疡术前；B：穿透性角膜移植术后；C：术后6mo；D：荧光素纳染色，上皮层完整修复；E：16wk UBM检查提示，角膜植片恢复自然曲率，内皮面植床与植片吻合处粗糙（箭头）

    图 4 自体角膜细胞再生 A：12wk时CACM上皮细胞复层化，基质细胞沿胶原板层排列×400；B：基质细胞移行最先出现于上皮层下，新生血管亦位于浅层×200；C：透射电镜照片上方是一个成纤维细胞，周边是分泌的胶原原纤维，与整齐排列的支架胶原混合在一起×15 000

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