3讨论

    糖尿病视网膜病变主要病理改变是视网膜微血管病变。周细胞丧失和微动脉瘤的形成是早期糖尿病视网膜改变的标志[4]。周细胞在视网膜的密度最高，引起周细胞丧失的因素很多，慢性高血糖是主要的因素，导致血管壁减弱产生微动脉瘤[5，6]。视网膜微动脉瘤超微结构分析揭示周细胞的缺失，证明血管的完整性丧失由于周细胞的丧失引起，使血管容易形成微动脉瘤和进展性的血管闭塞导致血管渗透性增加、黄斑水肿或新的增殖的形成和新生血管[7].进一步研究表明由于周细胞丧失与视网膜病变新生血管的发生以及毛细血管的发育和血管生长的停止有关，说明周细胞对毛细血管的生长起抑制性的影响[8]。但是有关周细胞丧失的详细机制仍然不清楚。周细胞可通过多种途径参与DR的发生、发展, 尤其与早期糖尿病视网膜病变形成密切相关[9,10], 因此建立视网膜毛细血管周细胞的原代、传代培养, 是研究周细胞在早期糖尿病视网膜病变发生发展中作用机制的实验基础。我们采用了两次筛网过滤结合除杂的方法, 所获得的细胞Ⅷ因子相关抗原抗体染色阴性,说明未混入内皮细胞;α-SMA抗体染色阳性, 证实为周细胞, 纯化率达95%以上。因此, 本研究成功建立了分离和培养视网膜毛细血管周细胞的有效方法。周细胞生长周期短,达到汇合所需时间短,易于传代,但是传至7或8代时细胞开始表现为老化,说明周细胞为一种代谢旺盛的细胞。随着培养基中葡萄糖浓度的增加,细胞形态有所改变。周细胞都逐渐丧失原有的形态特征,变得不均一,排列不规则。尤其是在葡萄糖浓度为30mmol/L时,周细胞数量未见减少,但是细胞肿胀、细胞边界欠清晰,这类细胞传代时容易老化,较早出现空泡和颗粒,属于非健康状态的细胞。高糖条件下培养的周细胞细胞数量及形态的异常改变,是糖尿病微血管病变发生的机制之一。

    我们通过免疫细胞化学发现对照组FOXO1A在周细胞轻度表达，而在高糖组和过氧化氢组FOXO1A显着表达，同时说明高糖和过氧化氢诱导FOXO1A的活性显着增加，且大量分布在细胞核和细胞质，也说明高糖诱导周细胞FOXO1A表达增加可能同过氧化应激。免疫蛋白印迹分析表明在高糖培养24h后FOXO1A蛋白水平降低而磷酸化FOXO1A蛋白水平增加，证明高糖早期急性诱导生存反应增加对周细胞具有保护作用。在高糖培养48h，72h后FOXO1A转录因子的活性增加，从而证明FOXO1A蛋白表达增加介导高糖诱导的周细胞损害有关。FOXO1A是FOXO转录调节因子家族成员之一，其上游受PI3K/PKB磷酸化级联通路的调节,下游调节的靶基因多与细胞周期、细胞凋亡、衰老及代谢有关。FOXO 的磷酸化及非磷酸化状态与转录调节功能有密切关系。FOXO因子享有一个共同的DNA结合序列且能激活转录通过直接或经其它相互作用的辅因子。FOXO1A被PI3K-AKT/PBK信号途径负向调控。在缺乏周围信号或生长因子时，FOXO1A位于细胞核，在PI3K诱导的丝氨酸/苏氨酸激酶AKT的激活后，FOXO1A被迅速磷酸化。磷酸化的FOXO1A结合到14-3-3 伴侣分子，分离FOXO1A在细胞质内，阻止返回到核内，导致功能性失活[11]。FOXO可以通过Fas 和Bcl-2 多途径活化caspase,诱导细胞凋亡。哺乳动物细胞的研究表明[12]， FOXO1A，FOXO3A和FOXO4A过量可诱导细胞发育停滞或凋亡。研究证明FOXOs转录因子调控p27、Fas 配体和Bcl-2 样蛋白Bim的表达[13-15]。伴随核内FOXO 表达增加,促凋亡基因FasL表达增强[15]。

    大量研究证明FOXO1A调控与血管稳定、再塑和凋亡相关基因表达。FOXO1A不仅调控Ang-2表达，同样增加一些直接促进血管失稳定的基因的表达。这些基因包括血管基质再塑有关的基因（decorin, lumican, fibulin-5, 和3型 collagen）或者与内皮细胞移动和管腔形成相关基因。因此血管FOXO1A的激活可能伴随着内皮细胞、周细胞、细胞外基质之间相互作用的改变。Ang-1 对血管具有稳定作用通过Ang-1抑制FOXO1A的功能，Ang-2 诱导的Ang-1/Akt信号的抑制导致FOXO1A的激活，使血管失去稳定性和血管细胞容易凋亡[16]。 同样有研究证明在增殖性糖尿病视网膜病变患者玻璃体Ang-2，VEGF水平显着增高比正常对照组[17]。因此进一步表明FOXO1A参与早期糖尿病视网膜病变的发生和发展。总之，本实验研究证明高糖诱导的视网膜微血管周细胞FOXO1A表达上调，有助于进一步理解糖尿病患者视网膜微血管病变的发病机制。

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