【摘要】目的：建立人腺样囊性癌耐药细胞系，为阐明腺样囊性癌的多药耐药机制及逆转耐药提供模型及研究依据。方法：以长春新碱（VCR）为诱导剂，通过浓度递增间断刺激法对人腺样囊性癌细胞系（ACC）进行体外诱导耐药，建立耐VCR的腺样囊性癌细胞系ACC/VCR。细胞计数法绘制细胞生长曲线，噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞对化疗药物敏感性。 结果：ACC经体外诱导后，ACC/VCR细胞对长春新碱（VCR）、阿霉素（ADM）和平阳霉素（PYM）的耐药性明显增强，具有交叉耐药，对环磷酰胺（CTX）、氟尿嘧啶（5-FU）和顺铂（DDP）耐药性无明显变化。耐药前后ACC细胞的生长曲线、群体倍增时间和光镜下的形态无明显改变。结论：VCR可诱导腺样囊性癌细胞产生多药耐药。

   【关键词】  腺样囊性癌　多药耐药　长春新碱

　　Establishment of multidrug cell line of human adenoid cystic carcinoma

    Xiao-Dong Zhou, Guo-Xiang Song, Zhi-Fang Sui, Ji-Wu Chang

    Tianjin Orbital Disease Institute, the Second Hospital of Tianjin Medical College, Tianjin 300211, China

    Correspondence to: Xiao-Dong Zhou. Tianjin Orbital Disease Institute, the Second Hospital of Tianjin Medical College, Tianjin 300211, China. [email protected]

     Abstract  AIM: To establish an in vitro resistance model of adenoid cystic carcinoma which can provide theoretical information for elucidating the mechanisms of multidrug resistance (MDR), improving the chemotherapy scheme, evaluating the prognosis and reserving the MDR in adenoid cystic carcinoma.METHODS: The resistance cell line, ACC/VCR, was induced in the ACC cell line in vitro by progressive concentrations of vincristine (VCR), a drug of choice in the treatment of adenoid cystic carcinoma. The growth curve, drug sensitivity in the parental and resistant cell lines were investigated by cell counting and MTT assay. RESULTS: ACC/VCR cell line was cross-resistant to vincristine (VCR), adriamycine (ADM) and pingyangmycin (PYM), but not resistant to Cyclophosphamide (CTX), fluorouracil (5-FU) and cisplatin (DDP). There was no significant difference in the doubling time and morphological changes between ACC cell line and ACC/VCR cell line. CONCLUSION: Exposing to VCR can induce MDR in adenoid cystic carcinoma.

    · KEYWORDS: adenoid cystic carcinoma; multidrug resistance; vincristine

    Zhou XD, Song GX, Sui ZF, Chang JW. Establishment of multidrug cell line of human adenoid cystic carcinoma. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) ,2007;7(2):417-419

     0引言

    腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma,ACC）是一种高度恶性的上皮性肿瘤，可发生于全身各部位，如涎腺、颌下腺、气管、肺、乳腺、皮肤等，于眼眶则好发于泪腺[1]。目前对腺样囊性癌的治疗以综合治疗为主，其中化疗主要作为新辅助化疗（术前或放疗前化疗）、辅助化疗（手术后或放疗后化疗）、放疗增敏剂和姑息性化疗应用[2]。有的肿瘤细胞在对一种化疗药物耐药的同时,对其他结构和机制不同的化疗药物也产生耐药性，称为肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance,MDR) [3]。多药耐药的产生是导致肿瘤产生耐药和化疗失败的重要原因之一。我们通过长春新碱诱导建立腺样囊性癌耐药细胞系，旨在为阐明腺样囊性癌的多药耐药机制，指导多药耐药逆转剂的研究提供模型和研究依据。

    1材料和方法

    1.1材料 人腺样囊性癌(ACC)细胞系购自上海申能博彩公司。RPMI1640干粉培养基(Gibco公司),胎牛血清(天津灏阳生物有限公司，56℃40min灭活补体),青、链霉素(石家庄制药厂),谷氨酰胺（L-glutamina）(Gibco公司)，胰蛋白酶(Sigma公司),依地酸二钠（EDTA）(广州化学试剂厂),二甲基亚砜（DMSO）(北京鼎国生物有限公司),噻唑蓝（MTT）(北京鼎国生物有限公司),长春新碱（vincristine,VCR）(上海华联制药有限公司),环磷酰胺(CTX)(上海华联制药有限公司),阿霉素(adriamycin,ADM)(深圳万乐药业有限公司),氟尿嘧啶(5-FU)(天津市氨基酸公司人民制药厂),平阳霉素(PYM)(天津太河制药有限公司)，顺铂(DDP)(山东齐鲁制药厂)。CO2培养箱（Heraeus，德国），倒置显微镜（Olympus-1M，日本），生物显微镜 （Olympus BH-2，日本），紫外分光光度计（UV754，上海分析仪器厂），台式高速离心机（Allegra64R，美国Beckman），磁力搅拌器（江苏省金坛市通济仪器厂），酶联仪（DG-3022A，南京电子管厂）。

    1.2方法 ACC细胞系培养在含100ml/L灭活胎牛血清、100kU/L青、链霉素的RPMI1640培养液中。培养条件：37℃，50ml/L CO2，每3d换液1次，2.5g/L胰酶、0.2g/L EDTA消化传代，约5d传代1次。采用VCR浓度递增间断刺激法选择耐药细胞，具体步骤如下：VCR 15μg/L×7d，去药7d，VCR 30μg/L×7d，去药7d，VCR 60μg/L×7d，去药7d，VCR 60μg/L×7d，去药7d，VCR 120μg/L×7d，去药7d，VCR 120μg/L×7d，去药7d，VCR 250μg/L×7d，去药7d，VCR 250μg/L×7d，去药7d，无药培养7d后进行实验。取生长状态良好的细胞，2.5g/L胰酶、0.2g/L EDTA消化制成细胞悬液，计数，将细胞悬液接种于24孔板，每孔1mL，接种浓度1×107/L，37℃，50ml/L CO2培养。每日取3孔板细胞进行计数，计算均值。连续观察7d，其间培养3d后给未计数的细胞换液。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），在半对数坐标纸上绘制生长曲线，根据公式计算细胞在对数生长期的倍增时间。TD(倍增时间) = t（培养时间h）×lg2/（lgNt-lgN0）。N0，Nt：接种后及培养t h后的细胞数。MTT比色实验[4]测定化疗药物敏感性：取对数生长期细胞，2.5g/L胰酶、0.2g/LEDTA消化，用含100ml/L胎牛血清的RPMI1640培养液配成5×106～1×107/L的单个细胞悬液；取96孔培养板，每孔加入200μL细胞悬液，37℃，50 ml/L CO2培养过夜；更换培养液，并按一系列浓度（终浓度分别为0.01，0.1，1，10，100、1 000 mg/L）加入抗肿瘤药物，每浓度重复3孔，以不加细胞只加培养液的孔作为空白对照，37℃，50 ml/L CO2培养72h；每孔加5g/L MTT溶液20μL，37℃，50 ml/L CO2继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，振荡10min，使其充分溶解；选择490nm波长，在酶联仪上测定各孔吸光度（A ）；按公式计算细胞存活率，以细胞存活率对药物浓度对数作图，求出药物半数抑制浓度（IC50），计算耐药系数（resistance factor,RF）。细胞存活率（%）=试验组吸光值A /对照组吸光值A×100%，RF=耐药细胞IC50/亲代细胞IC50。

    2结果

    2.1细胞系的建立 ACC细胞系经VCR体外诱导筛选，连续培养4mo，获得了在250μg/L VCR作用下生长良好的耐药细胞系。命名为ACC/VCR。无药培养2mo，对VCR的耐药指数无明显下降，说明已有稳定的耐药性。VCR在体外诱导耐药的培养过程中，加药后细胞出现肿胀，胞浆内颗粒较粗，细胞生长受抑，增殖速度很慢甚至不增殖，随之大量脱壁、数目减少。换用不含VCR的培养液培养，并适当延长传代周期，存活下来的耐药细胞生长分裂加快，形成多个细胞克隆，再逐渐融合成片，但细胞大小不一，排列紊乱，异型性较为明显。然后继续用含VCR的培养液筛选。经过几次筛选后，不耐药或耐药性低的的细胞被排除，余下的是有较高抗药性的细胞。

    2.2细胞形态学观察 ACC和ACC/VCR细胞在体外均为贴壁生长，在倒置显微镜下为多角形上皮样细胞，大小较为一致，胞质内可见透亮度深浅不等的颗粒，核大，类圆形或不规则形，核/质比例高，核仁2～3个，清晰可见的，并可见巨大融合细胞。细胞分裂相多见，并有多级核分裂，排列紧密时细胞互相镶嵌成铺路石样，密度再增高时可重叠生长，表现为接触抑制消失（图1A，B）。ACC和ACC/VCR细胞在体外增殖速度相似（生长曲线见图2）。群体倍增时间分别为28.32±1.65h和27.55±0.89h，两组间比较无显著性差异（t =1.162，P =0.311）。

    2.3耐药谱 ACC/VCR不仅对原诱导药物VCR具有耐药性，而且对ADM，PYM有交叉耐药性（表1）。各种化疗药物临床常用量所达血药浓度分别为：VCR 0.25mg/L；CTX 140mg/L；ADM 6mg/L；5-FU 50mg/L；PYM 20mg/L；DDP 5mg/L。

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