【摘要】 目的：观察可溶性Tie2融合蛋白（soluble Tie2 fusion protein, sTieFc）对小鼠脉络膜血管新生（choroidal neovascularization, CNV）的抑制作用。方法：采用激光击射的方法诱导成年C57BL/6小鼠CNV模型，术前及术后3，6，9d选取1眼玻璃体腔注入人sTieFc 0.67μg，对侧眼在相同时点注入人IgG作为对照。激光术后10d处死小鼠，行脉络膜灌流铺片及组织病理学检查观察CNV的发展，定量评价sTieFc对于实验性CNV的抑制作用。结果：术后10d所有激光光斑均发展为实验性CNV，脉络膜灌流铺片（16.7±4.0)×103mm2vs(30.2±5.1)×103mm2，P<0.01）及组织病理学检查（1.70±0.56vs3.07±0.91，P<0.01）结果一致表明sTieFc明显抑制了小鼠CNV的发展。结论：sTieFc可以抑制实验性CNV的发展。
【关键词】 脉络膜血管新生 Tie2 血管内皮生长因子
脉络膜血管新生（choroidal neovascularization, CNV）与许多眼病有关，常引起严重的视力障碍，其中年龄相关性黄斑变性（agerelated macular degeneration, AMD）是发达地区60岁以上老人视力障碍的主要原因[1]。随着研究的深入，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）及其受体系统在CNV发生发展过程中的重要作用已经成为共识[2]，拮抗VEGF的生物学疗法也已经开始应用于临床，显示出良好的治疗效果[3, 4]。血管生成素和Tie2（angiopoietinTie2）是最近研究较多的另一组血管内皮细胞特异性配体受体系统，包括4个配体（Ang1，2，3，4）和他们共同的受体Tie2，其中Ang1和Ang2在血管的发生以及各种血管新生过程中起着重要作用[5, 6]。有研究表明，Ang1、Ang2和Tie2在于手术摘除的CNV中有明显的表达[7]，提示阻断这一系统的作用可能成为防治CNV有效的生物学治疗方法之一。我们采用激光击破Bruch膜建立小鼠实验性CNV模型，定量分析可溶性Tie2融合蛋白（soluble Tie2 fusion protein, sTieFc）对CNV发展的抑制作用，为ADM及其它难治性新生血管性眼病的生物学治疗提供新的线索和依据。
1材料和方法
1.1材料
健康C57BL/6母鼠（Japan SLC Inc, Shizuoka, Japan）7wk龄，红色氪离子激光（波长630nm，MC7000，NIDEK），sTieFc（日本九州大学石桥达朗教授提供），人IgG（Pharmingen，San Diego，California），高分子量FITCdextran溶液（Mr：2×106，50g/L，Sigma，St.Louis，MO）。C57BL/6小鼠双眼采用激光击射的方法建立实验性CNV模型。以盐酸氯胺酮（100mg/kg）ip麻醉，美多丽滴眼液（MydrinP）散瞳。术前仔细观察眼底，证实所有实验动物眼底形态正常。采用红色氪离子激光，参数设置在能量150mW，光斑直径100μm，时间0.1s，选择视网膜后极部9，12，3和6点方位，避开大的视网膜血管，各击射1发，目的是击破Bruch膜，诱导实验性CNV产生。激光击射时光凝部位产生气泡被认为是击穿Bruch膜的标志，所以只有4个击射部位均有气泡产生的鼠眼入选本实验。
1.2方法
每只小鼠随机选取1眼归入实验组，分别在CNV模型建立的0，3，6，9d玻璃体腔注入人0.5μL sTieFc 0.67μg；对侧眼归入对照组，在相同时点注入等量的人IgG。CNV模型建立后10d，采用高分子量荧光试剂FICTdextran心内灌流脉络膜铺片检查和组织病理学检查观察实验组和对照组CNV的发展，并进行定量分析比较，评价sTieFc对实验性CNV发展的抑制作用。
1.2.1 FITCdextran灌流脉络膜铺片检查
取实验组及对照组小鼠各8眼32处光斑，按照Edelman等[8]描述的方法行FITCdextran灌流，脉络膜铺片检查。具体做法：将小鼠麻醉后固定，打开胸腔，将1mL FITCdextran溶液注入左心室，迅速摘除眼球固定于40g/L甲醛中，1～2h后在手术显微镜下除去角膜、晶状体和视网膜，制作脉络膜铺片，于荧光显微镜下观察、照相。同时应用MacScope软件测算每个光斑处实验性CNV的面积，计算各组平均值。
1.2.2组织病理学检查
取实验组及对照组小鼠各8眼32处光斑，将动物处死后摘出眼球，100g/L甲醛固定24h，常规脱水，石蜡包埋。选取激光光凝部位矢状面平行视神经6μm连续切片，HE染色，光镜观察、照相。同时应用MacScope软件测量每个光斑处实验性CNV的最大厚度（光斑中心脉络膜底部与新生血管膜顶点之间的距离，B）与周围正常脉络膜厚度（C）的比值（B/C），计算各组平均值。
统计学处理：采用student’sttest。
2结果
FITCdextran灌流脉络膜铺片检查证实光凝后10d对照组的所有光斑处均发展为实验性CNV，具体表现为由扁平血管构成的网状结构，较宽大（图1A），有时可以观察到实验性CNV与周围脉络膜之间的交通血管。实验组的所有光斑亦均发展为实验性CNV，但血管网的面积较小，有的由于血管数目太少不能构成网状结构或仅表现为血管环(图1B)。测量CNV面积的定量分析显示对照组和实验组CNV的面积平均分别为(30.2±5.1)×103mm2和(16.7±4.0)×103mm2，实验组CNV的发展明显受到抑制(P<0.01)。组织病理学的检查也显示实验组的CNV较薄、较小（图2A, B），测量CNV厚度比值（B/C）的定量分析显示对照组和实验组CNV的厚度比值平均分别为3.07±0.91和1.70±0.56，实验组CNV的发展明显受到抑制(P<0.01)。
3讨论
血管新生（angiogenesis）是指从现有血管长出毛细血管芽的复杂过程，见于创伤的修复和一些病理过程，其发生是由于局部血管新生促进因子和血管新生抑制因子之间的平衡被打破的结果。研究表明，有许多因子参与血管新生的过程，除VEGF受体系统之外，血管生成素Tie2系统在体内各种血管新生过程中的重要作用逐渐受到重视。VEGF及其受体基因敲除鼠的血管系统发生完全障碍，幼鼠在胚胎早期死亡[9]；而Ang1和Tie2基因敲除鼠的血管系统得到了初步的发育，管腔已经形成，血管内皮细胞的数量也在正常范围，但是这些血管不能进一步分化、成熟，致使幼鼠在胚胎发育晚期死亡[10]，这提示Ang1和Tie2在血管分化成熟、稳定结构方面有重要作用。Ang2是Ang1天然的拮抗剂，与血管内皮细胞上Tie2结合后并不引起受体的磷酸化，竞争阻断Ang1的生理作用[6]。缺氧状态和VEGF可以上调Ang2的表达，进而促进内皮细胞增殖、出芽、移行，基底膜降解，利于新生血管的形成[11, 12]。眼部新生血管的研究显示，手术摘除的CNV膜中Ang1，Ang2和Tie2表达明显[7]，而阻断Tie2的作用可以抑制实验性视网膜新生血管的发展[13]。我们采用激光击破Bruch膜建立小鼠实验性CNV模型，通过玻璃体腔内注射sTieFc阻断Tie2的作用，结果CNV发展受到明显的抑制。应用受体可溶性蛋白阻断配体的作用是常用的实验方法[14]，作用机制是受体可溶性蛋白竞争性与配体结合，阻断或减弱后者通过体内功能性受体发挥的生理作用。本研究结果表明血管生成素Tie2系统在CNV发展过程中的重要作用，同时也首次证明了拮抗Tie2可以抑制CNV发展，为AMD与其他难治性新生血管性眼病，如糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、缺血型视网膜静脉闭塞症及角膜血管新生等疾病的治疗带来新的希望。
Takagi等[13]的研究表明sTieFc和VEGF受体1可溶性蛋白（sFlt1Fc）均可以抑制视网膜血管新生的发展，后者的作用更强，同时给与sTieFc和sFlt1Fc可获得最大新生血管抑制作用，说明VEGF与血管生成素系统在视网膜血管新生过程中都起作用，效应协同，其中前者的作用较强，对于CNV还没有类似的研究。近期我们报告了VEGF受体2（FLK1）mAb可以抑制实验性CNV的发展[15]，使CNV的面积和厚度（B/C）比值分别减少了61.9%和45.3%；通过计算，本研究中sTieFc使CNV的面积和厚度（B/C）比值减少了44.5%和44.6%，提示其作用略弱于阻断VEGF系统。但是两个研究采用的单克隆抗体和受体可溶性蛋白是不同的阻断方法，其阻断效能可能不同，若要确切考察VEGF与血管生成素系统在CNV发展过程中的作用仍需进一步研究。
【参考文献】
1 Zhang SX, Ma JX. Ocular neovascularization: Implication of endogenous angiogenic inhibitors and potential therapy. Prog Retin Eye Res 2007;26:137
2 Witmer AN, Vrensen GF, Van Noorden CJ, et al. Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Prog Retin Eye Res 2003;22:129
3 Rosenfeld PJ, Brown DM, Heier JS, et al. Ranibizumab for Neovascular AgeRelated Macular Degeneration. N Engl J Med 2006;355:14191431
4 Brown DM, Kaiser PK, Michels M, et al. Ranibizumab versus Verteporfin for Neovascular AgeRelated Macular Degeneration. N Engl J Med 2006;355:1432 1444
5 Suri C, Jones PF, Patan S, et al. Requisite role of angiopoietin1, a ligand for the TIE2 receptor, during embryonic angiogenesis. Cell 1996;87:11711180
6 Maisonpierre PC, Suri C, Jones PF, et al. Angiopoietin2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science 1997;277:5560
7 Otani A, Takagi H, Oh H, et al. Expressions of angiopoietins and Tie2 in human choroidal neovascular membranes. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999;40:19121920
8 Edelman JL, Castro MR. Quantitative image analysis of laserinduced choroidal neovascularization in rat. Exp Eye Res 2000;71:523533
9 Shalaby F, Rossant J, Yamaguchi TP, et al. Failure of bloodisland formation and vasculogenesis in Flk1 deficient mice. Nature 1995;376:6266
10 Sato TN, Tozawa Y, Deutsch U, et al. Distinct roles of the receptor tyrosine kinases Tie1 and Tie2 in blood vessel formation. Nature 1995;376:7074 |
