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1材料和方法
1.1材料 hRPE细胞来源于角膜移植供体的健康成人眼球。DMEM/F12培养基、胎牛血清、小牛血清、2.5g/L胰蛋白酶均为Gibco公司产品，EDTA粉、PBS粉为Sigma公司产品，SDF1α为美国PEPROTECH公司产品，鼠抗人角蛋白质18抗体、鼠抗人PCNA单克隆抗体为美国ZYMED公司产品，二步法组化检测试剂盒（北京中杉金桥公司）。
1.2方法 hRPE细胞的取材（眼杯消化法[3]）和培养：取角膜移植供体的健康成人眼球，用灭菌冰盒转移至超净工作台内，修剪球壁结缔组织，750mL/L酒精润洗眼球2次，用含500U/mL青霉素的PBS液冲洗干净，由角膜缘后3.5mm处环形剪开眼球壁，去除眼前节、玻璃体。将后段眼杯置于自制的眼球托上，不含血清的DMEM/F12培养液冲洗眼杯并用滴管反复吹打使眼球内壁表面菲薄的视网膜神经上皮层脱离，加入2.5g/L胰蛋白酶后放入培养箱中静置消化10min。取出吸除其中液体，再加入2.5g/L胰蛋白酶后放入培养箱中静置消化30min。取出后加含150mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液（完全培养液）终止胰蛋白酶反应，并用滴管吹打眼球内壁以使RPE细胞脱落分散。将含RPE细胞的液体移入离心管中，1000r/min离心10min，弃上清液。加入少许2.5g/L胰蛋白酶再次消化，吹打约5min后再加入完全培养液终止消化。再次离心弃上清液后加入完全培养液将RPE细胞悬浮并以2.0×105接种于25cm2培养瓶中，置于37℃、50mL/L CO2培养箱中培养。hRPE细胞的鉴定：角蛋白18免疫细胞化学染色鉴定采用标准化的SP法，取部分细胞进行细胞爬片，5d后取出盖玻片，在25℃室温下用PBS冲洗后40g/L多聚甲醛固定15min；PBS冲洗后加入10g/L TritonX100破膜20min；PBS冲洗后加入30mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶活性25min；PBS冲洗后加入羊血清封闭20min；加入一抗（鼠抗人角蛋白18单克隆抗体1:200稀释）37℃湿盒孵育80min；PBS冲洗后加入二抗（生物素标记的羊抗鼠IgG抗体）37℃湿盒孵育30min；加入链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶37℃湿盒孵育30min；PBS冲洗后直接DAB显色6min，苏木素复染，中性树胶封片。MTT法：检测不同浓度SDF1α对体外培养的hRPE细胞增殖活力的影响取第3～4代细胞，常规消化离心后，按每孔103～104个接种于96孔板，每孔200μL，培养24h后弃上清液，每孔加入200μL含有不同浓度SDF1α(0，25，50，75，100μg/L)的DMEM/F12培养基，每一浓度设3复孔，培养72h，每孔加入MTT 20μL，继续培养4h，弃去培养液，加入 DMSO 150μL震荡10min。酶联免疫检测仪测在490nm处的吸光度值OD。免疫细胞化学染色法检测添加SDF1α前后hRPE细胞内PCNA的表达情况：细胞爬片制作好后取出盖玻片，在细胞生长面做标记。PBS冲洗3min，3次，用40g/L甲醛固定10min。PBS冲洗3min，3次，甩干后滴加1滴表面活性剂Triton X100，室温下孵育20min以增加生物膜的通透性。滴加30mL/L H2O2封闭H2O2酶15min。PBS冲洗3min，3次，加入PCNA单克隆抗体孵育120min。PBS冲洗3min，3次，加入PCNA二抗孵育60min。PBS冲洗后直接DAB显色6min。苏木素复染，中性树胶封片。结果判断：本实验使用酶联免疫检测仪检测MTT的光密度值，采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对PCNA的表达进行半定量分析，每个标本随机选取5个不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的光密度，以每个视野下5个视野光密度的平均值作为该例的测量值。
图1 人视网膜色素上皮细胞的体外培养（P3）镜下观察（×100）（略）
图2 不同SDF1α浓度组的吸光度曲线(吸光度随着SDF1α浓度增高而增大，两者呈正相关（略）
统计学处理：统计数据采用SPSS 11.0统计软件处理，以P<0.05作为差异有统计学意义的检验标准,P<0.01作为差异有显著统计学意义的检验标准。
2结果
2.1人视网膜色素上皮细胞的体外培养（P3）镜下观察 消化取材的hRPE原代细胞镜下为圆形，大小不一，胞体透亮，内含大量的色素颗粒，胞核无法辨认。当细胞贴壁后，细胞变扁平不规则的多角形，胞浆丰富，内可见黑色素颗粒，相对集中地分布于核的周围，核呈圆形或卵圆形，境界清晰，核仁明显，大小不一，数目不等，呈小圆形，细胞之间具有一定的联系。细胞贴壁后第3d增殖速度明显加快，至4～5d即可基本融合，细胞呈五角或六角形，细胞仍具有极性，色素偏向细胞一侧，与体内RPE细胞形态相似。细胞培养液内可见大量脱失的色素颗粒。细胞胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少（图1A，B）。
图3 添加SDF1α前后hRPE细胞内PCNA的表达 （略）
A为阴性对照，B、C为正常对照组，D、E为实验组
2.2 MTT法 检测不同浓度SDF1α对体外培养的hRPE细胞增殖活力的影响 (图2)：0,25，50，75，100μg/L组SDF1α的吸光度值分别为：0.11±0.05，0.22±0.05，0.4±0.8，0.6±0.9，0.8±0.9。差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3免疫细胞化学染色法检测添加SDF1α前后hRPE细胞内PCNA的表达情况 PCNA抗原以细胞核内出现棕色颗粒为阳性反应，阴性对照组细胞核全部染成蓝色，胞浆和胞外均无棕黄色反应物（图3A）。正常对照组可见部分细胞核呈棕色，PCNA阳性表达（图3B，C）。实验组大量细胞核呈棕色或棕褐色，强阳性表达(图3D，E)。镜下观察对PCNA的表达进行半定量分析，正常对照组和实验组的光密度分别为：0.184±0.015，0.120±0.009。两组图像的分析结果经t检验分析，组间差异有极显著统计学意义（P<0.01）。
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