【摘要】 目的：探讨体外Müller细胞在糖基化终末产物（AGEs）作用下增殖活性的变化。 方法：采用本实验室培养及鉴定的新生大鼠Müller细胞，设置正常生长组和添加AGEs培养组，AGEs浓度在250～1000mg/L范围内逐步递增。MTT法测定AGEs对体外纯化培养Müller细胞增殖的影响和分泌VEGF的改变。 结果：高浓度AGEs对Müller细胞有明显的促增殖作用，并且促进Müller细胞分泌VEGF,并在一定的浓度范围内（250～1000mg/L）细胞增殖活性呈剂量依赖关系。 结论：体外高浓度AGEs可促进Müller细胞异常增殖和VEGF表达增加，与临床上观察到增殖性糖尿病视网膜病变时胶质细胞反应性增生情况一致，因此可以在体外用高浓度AGEs模拟体内糖尿病环境，观察胶质细胞形态和功能的改变。
【关键词】 糖基化终产物；Müller细胞；增殖；血管内皮细胞生长因子
Advanced glycosylation end products promote the growth of retinal Müller cells in vitro
Hui Ye1,GeZhi Xu2, WenJi Wang2
1Department of Ophthalmology, Jiangsu Provincial Peoples Hospital, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China; 2Shanghai EENT Hospital Affiliated to Shanghai Fudan University, Shanghai 210023, China
AbstractAIM: To observe the effect of advanced glycosylation end products (AGEs) on the growth of retinal glial cells
in vitro.
METHODS: The Müller cells were exposed to different concentrations of AGEs (2501000mg/L). And the normal Müller cells were as controls. The growth characteristics were measured with MTT assay and VEGF in medium concentration was assayed by ELISA.
RESULTS: It was demonstrated that AGEs with high concentration promoted the growth and VEGF of Müller cells and this effect was dosage dependent within 2501000mg/L.
CONCLUSION: Interaction of Müller cells and AGEs is related to the formation and development of DR.
KEYWORDS: glycosylation end proclucts; müller cells; proliferation; VEGF
Ye H, Xu GZ, Wang WJ. Advanced glycosylation end products promote the growth of retinal Müller cells in vitro. Int J Ophthalmol
(Guoji Yanke Zazhi)2008;8(11):22172218
0引言
高血糖是引起糖尿病并发症的主要原因，且血糖增高的程度与并发症发生率直接相关。高血糖状态主要通过在体内发生广泛的糖基化作用而引起一系列病理反应。体内的葡萄糖等酮糖与体内的多种蛋白质，尤其是长寿命蛋白质，如胶原蛋白、基质蛋白发生糖基化作用，最终生成具有荧光性的糖基化终末产物（AGEs）。已知，AGEs在糖尿病慢性并发症的发生发展中具有重要作用，在高血糖患者的血清、血管壁上可检测到AGEs的高表达，视网膜病变程度与AGEs含量呈正比。因此，我们用体外细胞培养中添加高浓度的AGEs来模拟体内糖尿病环境，观察该培养条件下Müller细胞增殖活性的变化，及其VEGF分泌功能的影响，从而研究DR中Müller细胞形态和功能的变化。
1材料和方法
1.1材料 牛血清蛋白（德国Biochrom KG Seromed公司），D葡萄糖，苯甲基磺酰氟（美国GIBCO公司），VEGF ELISA试剂盒（美国Quantikine R&DSYSTEM）。台式低温高速离心机（581OR），分光光度计（德国Eppendorf公司），酶标仪（680型）（美国Biorad公司），微量加样器及吸头（美国Gilson）公司。
1.2.1糖基化终末产物（advanced glycosylation end products，AGEs）的制备和鉴定 取5g无球蛋白的牛血清蛋白（bovein serum albulim，BSA）与0.5mol/L D葡萄糖和1.0mol/L苯甲基磺酰氟共同溶解于0.2mol/L磷酸缓冲液中，过滤除菌，置37℃孵箱内孵化90d。产物经0.15mol/L氯化钠和0.02mol/L磷酸钠缓冲液透析、抽滤纯化后，测定葡萄糖浓度为零，考马斯亮蓝方法测定蛋白质含量，370nm激光下荧光分光光度计鉴定AGEBSA。AGEBSA对照物的制备：除不加葡萄糖外，其它材料及方法同上。
1.2.2 MTT法测定AGEs对体外纯化培养Müller细胞增殖的影响 选取本实验室培养的牛视网膜2～3代Müller细胞，经免疫组化和细胞电镜证实为Müller细胞[1]，消化后以4×103/孔接种于96孔培养板,实验组与对照组各6组，每组6孔,2h后待Müller细胞贴壁后，实验组和对照组分别加入AGEs及其对照物BSA，浓度梯度为2000,1500,1000,500,250,100,10mg/L，培养20h后加入MTT（1.5g/L，PBS配制）20uL/孔，4h后在Mode l450酶标仪（BioRad公司）上测各孔吸光度（A）值。
1.3 ELISA法测定Müller细胞分泌VEGF的变化 将第2～3代细胞以每孔3×104的密度接种于5个12孔板，培养3d后，将培养液换为无血清的DMEM培养液培育24h，再弃掉无血清培养液，换成含不同浓度AGEs的DMEM培养液。分为5组：1000,500,250,100,0mg/L。于12,24,48,72h后收集培养液，标本检测前储存于20℃备用，采用酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），测定VEGF量。
统计学处理：应用SPSS 11.5统计软件对数据进行两因素方差分析，Excel XP软件绘图，以P＜0.05或0.01作为差异有统计学意义的标准。
2结果
2.1不同浓度AGEs对Müller细胞增生的影响 测试发现，高浓度AGEs对Müller细胞有明显的促增殖作用，在一定的浓度范围内（250～1000mg/L）细胞活性强度呈剂量依赖关系。AGEs的最佳效应浓度为1000mg/L。对照组（BSA组）Müller细胞增殖活性没有变化（图1）。
2.2不同浓度AGEs对Müller细胞表达VEGF的影响 结果显示，正常培养条件下鼠视网膜Müller细胞可分泌VEGF。在任一浓度组，Müller细胞表达VEGF随着培养时间的增加而增多。在同一时间段，低浓度AGEs对VEGF的表达无影响，而高浓度AGEs明显促进VEGF表达，并呈浓度依赖性。数据采用两因素方差分析,差异有统计学意义（图2）。
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