【摘要】  【目的】 研究thapsigargin（TG）对体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01/04增殖的影响，并探讨其分子机制。【方法】 不同浓度TG处理SRA01/04细胞72 h，噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞增殖；流式细胞仪（PI法）检测细胞周期改变；透射电镜观察细胞超微结构变化；TUNEL法检测细胞核中DNA的断裂情况；激光共焦显微镜和流式细胞仪检测Caspase3活性亚单位（17/19 ku）的表达及阳性细胞表达率。【结果】 MTT法测得TG为0.325～5 μmol/L时，细胞增殖抑制率变化显著，IC50大约为0.8 μmol/L;透射电镜显示TG处理SRA01/04细胞膜皱缩，染色体浓缩、边集、核膜裂解、凋亡小体形成;流式细胞仪（PI法）及TUNEL法检测TG浓度为0，0.1，0.5，1，10 μmol/L分别处理SRA01/04细胞72 h，细胞凋亡率随浓度的增加而增加，呈浓度依赖性;TG处理后细胞Caspase3阳性表达率也呈浓度依赖性增加,TG为10 μmol/L时，几乎每个细胞浆内Caspase3都被激活。【结论】 Thapsigargin可能通过激活Caspase3为诱导体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞凋亡而抑制其增殖，TG为预防后发性白内障的药物研究提供了基础。

    【关键词】  Thapsigarigin； 晶状体上皮细胞； 细胞凋亡； Caspase3

    Effect and Mechanism of Thapsigargin on Proliferation of Human Lens

    Abstract: 【Objective】 To investigate the effect of thapsigargin (TG) on the proliferation of human lens epithelial cells line SRA01/04 in vitro and underlay the molecular mechanism. 【Methods】 SRA01/04 cells were exposed to TG for 72 h, the drug-free medium was as control. Effect of TG on cell growth was assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay. Ultrastructure was observed by transmission electron microscopy. DNA fragmentation was measured by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-nick end-labeling (TUNEL). Cell cycle analysis was determined by flow cytometry (FCM) with propidum iodine (PI) staining. Expression of cleaved caspase 3 protein was detected by confocal microscopy and flow cytometry. 【Results】 The growth of  SRA01/04 cells were inhibited obviously by TG at concentration ranged from 0.325 to 5 μmol/L. The ultrastructure of treated SRA01/04 cells showed typically apoptotic characteristics, including chromatin condensation, chromatin crescent formation, nucleus fragmentation and apoptotic body formation. Exposed to 0, 0.1，0.5，1.0, 10 μmol/L TG for 72 h, the apoptotic rate by flow cytometry (PI means) and TUNEL were increased in a concentration-dependent manner. The expression of caspase3 was activated by TG，the cleaved caspase3 was expressed in a concentration dependent manner. The positive rate was about 100% at the concentration of 10 μmol/L. 【Conclusion】 The growth of SRA01/04 cells were inhibited by thapisigargin in a concentration dependent manner in vitro by inducing up-regulation of caspase 3 activation and starting apoptosis pathway. Thapisigargin may be developed as a potential therapeutic drug for posterior capsule opacification prevention.

    后发性白内障是白内障术后影响视功能的严重的远期并发症之一，白内障术后残留的晶状体上皮细胞增殖、迁移、化生是其发生的病理基础[1]。目前手术中技术和人工晶状体的光学部设计等方面的改进使后发性白内障的发生率有所下降[2,3]，但白内障术后残留的晶状体上皮细胞的增殖仍是眼科界亟待解决的的难题。后发性白内障防治的关键是发现一种能有效抑制晶体上皮细胞增殖且无明显毒性作用的药物。Thapsigargin(TG)是上世纪70年代从草药Thapsia garganica根部所提取的一种蓓半萜内酯，特异性抑制细胞内质网钙泵[4]，破坏Ca2+的动态平衡，影响晶状体上皮细胞增殖等生物学功能[5，6]。我们将TG处理体外培养的人晶状体上皮SRA01/04细胞，研究TG能否抑制SRA01/04细胞的增殖，并探讨其分子机制，为药物防治后发性白内障提供新途径。

    1   材料和方法

    1．1   材   料

    人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞：由Ruddy实验室建立，美国Tuft大学的商福教授馈赠。主要试剂：Thapsigargin(TG)、Hoechst33342、MTT、PI、RNase A、多聚赖氨酸（均为美国Sigma公司产品）；cleaved caspase3抗体（cell signaling）；TUNEL试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；DMEM培养基、新生牛血清（美国Gibco公司产品）。主要仪器：CO2培养箱（美国SHELLAB公司）， CKX41型倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），LSM510型激光扫描共焦显微镜（德国Zeiss公司），荧光显微镜（德国Axioplan2 imaging），FACS Aria流式细胞仪（美国BD公司），H-600型透射显微镜（日本日立公司）。

    1.2   方   法

    1.2.1   细胞培养   用含10%新生牛血清，100 U/mL青链毒素的低糖DMEM培养基，置于5%CO2，37 ℃的细胞培养箱内培养。每次实验均取自同一批传代细胞。

    1.2.2   噻唑蓝比色法   按每孔3×103细胞接种于96孔板，24 h后处理，每组5个复孔。MTT法检测吸光度（A值）。细胞相对生长抑制率=1-（实验组A值/对照组A值）×100%。

    1.2.3   流式细胞仪检测   对数生长期细胞用含0.1，0.5，1.0，10 μmol/L TG培养液培养72 h，对照组加相同浓度的溶剂DMSO。收集细胞，70%乙醇固定，RNase A处理后PI染色，流式细胞仪检测PI荧光强度。                

    1.2.4   透射电镜   细胞消化传代，24 h后更换含1 μmol/L TG的完全培养液，对照组含相同浓度DMSO。培养72 h后常规固定、脱水、包埋、切片后透射电子显微镜观察。

    1.2.5   TUNEL法标记凋亡细胞   对数生长期SRA01/04细胞按8 × 104个/张种植于22 mm×22 mm的多聚赖氨酸处理的盖玻片上，TG处理（方法同前）后，严格按照说明书进行操作。随机计算6个高倍视野中阳性细胞数及总的细胞数，核棕色为阳性结果。阴性组以PBS代替TdT酶，阳性对照以DNA酶I（DNase I,10 μg/mL）室温下处理10 min后再进行TUNEL操作，分别计算阳性率。

    1.2.6   共聚焦显微镜   SRA01/04细胞处理同前，固定后一抗、二抗孵育，Hoechst 33342染色，激光共焦显微镜下观察。

    1.2.7   流式细胞仪检测cleaved caspase3的表达   SRA01/04细胞处理后收集细胞固定，一抗、二抗孵育，以无细胞标本作为阴性对照，流式细胞仪分析阳性细胞表达率。

    1.3   统计学分析

    运用SPSS 13.0软件进行统计学分析，对不同浓度TG作用72 h后各组检测结果采用非参数检验方法（Kruskal-Wallis Test）和单因素方差分析（ANOVA），组间比较采用SNK （Student-Newman-Keuls）法，取?琢=0.05。

    2   结   果

    2.1   细胞生长曲线

    当TG浓度为0.325～2.5 μmol/L时，细胞增殖抑制率变化显著，且呈剂量依赖性，IC50约为0.8 μmol/L(图1)。

    2.2   细胞周期分布变化

    流式细胞仪检测显示，正常组仅有正常的G1峰，未见亚二倍体峰；而TG处理组72 h的G1峰左侧出现亚二倍体峰型，且该峰在整个细胞周期中所占百分比例随着TG浓度的增加而增加，具有浓度依赖性。统计采用 ANOVA 法，F =9412.58，P﹤0.05。各组间比较均有显著性差异（P﹤0.01，图2）。

    2.3   细胞超微结构的改变

    TG处理组中细胞的胞浆发生浓缩，胞核内染色质浓集、贴边聚集在核膜周围、染色质形成新月体样变化和凋形成亡小体等典型的细胞凋亡改变的特征（图3）。

    2.4   细胞原位凋亡标记

    原位末端标记的SRA01/04细胞中，细胞核内存在棕黄色/棕褐色的颗粒状沉淀，形状不一，有的核全染，有的染成新月状，有的呈点状。在正常对照组，TUNEL阳性颗粒非常少见，而随着TG浓度的增加，TUNEL阳性细胞所占百比例随着增加，呈浓度依赖性（图4）。

    2.5   Capase3活性亚单位的阳性表达

    美国cell signaling公司最新生产的兔抗人cleaved Caspase3抗体能特异性检测Caspase3的17/19 ku活性亚单位，而对完整的Caspase3及其它Caspases的活性片段无免疫反应。细胞核（Hoechst 33342，蓝色荧光）体积变小或者形成凋亡小体等具有凋亡特征的细胞的胞浆内出现点状或者弥漫性cleaved Caspase3免疫反应阳性荧光（FITC，绿色荧光），而细胞核形态完全正常者则表现为cleaved Caspase3免疫反应阴性（图5）。

    该结果证实了Caspase3只在细胞凋亡时被激活理论，同时也说明TG可能通过Caspase家族诱导人SRA01/04细胞凋亡，区别于少数非Caspase家族凋亡途径。

    另一方面流式细胞仪检测cleaved Caspase3细胞阳性表达率的结果显示：随着TG浓度的增加，cleaved Caspase3细胞阳性表达率明显增加，且呈剂量依赖性，当TG为10 μmol/L，几乎为100%（图6）。统计分析采用ANOVA，F=127.779，P﹤0.001。除0.1 μmol/L及0.5 μmol/L组无显著性差异（P=0.140），其余各组间比较均有显著性差异（P﹤0.01）。

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