角膜结膜及泪器病             860                                      PO0229

　　Pegfp-Bfgf基因转染人角膜缘干细胞的实验研究

　　赵敏  夏凉

　　重庆医科大学附属第一医院眼科400016

　　目 的 研究pEGFP-bFGF基因转染体外培养的人角膜缘干细胞（HLSCs）及转染后对NaOH损伤的抵抗作用，探讨从基因水平上治疗眼表疾病的可行性，为基因工程技术和干细胞移植结合治疗眼表疾病提供初步的实验依据。

　　方 法 取新鲜尸眼，按组织块培养法培养细胞，AE5作鉴定。借助载体pEGFP-C1，通过脂质体，将 bFGF基因转染HLSCs，荧光显微镜下观察其表达情况，并继续培养观察其生长状态。然后制作NaOH细胞损伤模型，实验分为未转染组（Normal）、基因转染组（bFGF）、未转染损伤组（NaOH）和转染损伤组（bFGF+NaOH）。MTT测细胞存活状况及激光共聚焦显微镜（LSCM）观察细胞凋亡及坏死情况。

　　结 果 体外成功培养HLSCs，AE5在HLSCs原代细胞呈阴性表达，而在传代细胞呈阳性表达。成功将pEGFP-bFGF基因转染HLSCs，48后荧光显微镜下可见特异性的绿色荧光，基因转染率为20-30%，转染细胞与未转染细胞均生长良好。bFGF+NaOH组细胞存活状况高于NaOH组(p＜0.05），细胞凋亡及坏死率也明显低于NaOH组(p＜0.001）。

　　结 论 1、利用组织块法体外成功培养出HLSCs并传代，随着细胞的传代细胞增殖能力减弱，继续传代能力差。原代细胞AE5表达阴性，说明细胞可能为原始的干细胞；而细胞传代后已分化，AE5表达阳性。2、利用脂质体转染法能将pEGFP-bFGF基因转染HLSCs并得到表达，转染的细胞生长良好，说明应用基因工程，通过载体能将外源性基因转染HLSCs并且对细胞无明显毒性作用。3、被bFGF基因转染的HLSCs能够减轻NaOH的损伤，说明bFGF对碱损伤的HLSCs具有保护作用。

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