【摘要】 目的:观察青光安颗粒对体外加压培养人小梁细胞活性的影响, 探讨青光安颗粒预防与治疗原发性开角型青光眼术后眼压回升的作用机制。方法:制备2.5倍,5倍,10倍,20倍青光安颗粒含药血清和5倍益脉康含药血清，用不同药物与浓度的含药血清分别作用体外加压培养人小梁细胞12,24,36h,观察细胞形态学的变化和MTT法检测的细胞活性（OD）的变化。结果:加压后小梁细胞的OD值与青光安颗粒的浓度和作用时间均有关系。青光安5倍,10倍,20倍组都能够明显提高细胞OD值,与空白组比较有显著性差异（P＜0.01)，10倍,20倍组与益脉康组比较有显著性差异（P＜0.01)，但是青光安10倍组与20倍组之间没有统计学意义；培养24,36h的OD值明显高于培养12h的OD值(P<0.01)，但是培养24h与培养36h时间段之间没有统计学意义。结论:青光安颗粒能够提高加压后人眼小梁细胞的活性。
【关键词】 青光安颗粒 含药血清 人小梁细胞 活性 MTT法
0引言
原发性开角型青光眼是青光眼主要致盲疾病之一, 迄今为止, 其病因及发病机制尚不清楚。现已证明, 原发性开角型青光眼的眼压升高是由于房水排出通道的病变, 使房水排出阻力增加所致。房水流出通道大部分衬覆有小梁细胞, 研究证明小梁细胞具有多种功能, 诸如吞噬、收缩、合成及分解糖蛋白, 产生前列腺素等生物活性物质, 这些功能使得小梁细胞在房水排出的生理和病理过程中具有重要影响[1]。以往研究表明小梁细胞数量减少是原发性开角型青光眼小梁组织的重要改变[2]。益脉康片是以灯盏细辛为主要药材的单方制剂，药理研究表明能够对视网膜视神经节细胞、小梁细胞、血管内皮细胞、肝细胞等具有保护作用，抑制细胞凋亡[3]，同时能够明显改善眼压已控制的青光眼患者视盘和视盘旁视网膜微循环[4]，临床研究表明具有改善眼压已控制的青光眼患者视野等作用[5]。青光安颗粒剂是集我院眼科多年临床经验结合现代制剂制备工艺研制而成,主要成分是黄芪、生地、茯苓、车前子、地龙、赤芍、红花、白术等，共奏益气养阴、活血利水的作用。应用于临床能够明显提高青光眼术后患者的视力，扩大视野，预防其术后眼压回升,但其预防术后眼压回升的作用机制尚不十分清楚。因此, 我们在对人眼小梁细胞培养加压的基础上, 用MTT法研究了不同浓度青光安颗粒含药血清对加压后小梁细胞活性的影响,并且与益脉康片含药血清组进行对照， 以探讨青光安颗粒预防原发性开角型青光眼术后眼压回升的作用机制。
1材料和方法
1.1材料
药物:青光安颗粒剂（批号020208）由湖南中医药大学第一附属医院药剂科制备,产品批号020208；益脉康片剂由湖南湘雅制药有限公司生产，产品批号国药准字Z20010081。动物:3月龄的SD大鼠30只，由湖南农业大学动物实验中心提供。雌、雄不拘，体质量160～180g。主要试剂：胎牛血清(杭州四季清公司生产) ；DMEM培养基(3.6g/包, 美国GIBCO 公司生产)；磷酸盐缓冲液PBS粉（福州迈新生物公司）；不含Ca2＋，Mg2＋的Hanks液（自配）；2.5g/L胰蛋白酶粉( 美国GIBCO 公司生产) ；青链霉素双抗(Hyclone公司生产) ；二甲基亚砜(上海生物工程公司生产) ； MTT(鹏程生物公司生产)。主要仪器:超净工作台(苏州安泰空气技术公司生产)；CO2培养箱(2300型,USA生产)；倒置相差显微镜(南京江南光电公司生产)；数码相机(佳能公司生产)；低速离心机(长沙平凡仪器仪表公司生产)；低温冰箱(日本SANYO公司生产)；50cm2 培养瓶、96孔培养板(美国COSTER 公司生产)；血球计数板(上海求精生化公司生产)；酶联免疫检测仪(Austria生产)；细胞加压模型（自制）。细胞来源及特性:人小梁细胞（human trabecular cells,HTCs）细胞株,由中山大学中山眼科中心卓业鸿教授提供。经纤维粘连蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）相关抗原免疫细胞化学鉴定均为阳性,倒置显微镜下观察细胞介于上皮细胞型和成纤维细胞型之间,形态多样，梭形、椭圆形、纺椎形和不规则形等,被证实所培养的细胞为人小梁细胞。
1.2方法
含药动物血清制备 SD大鼠30只，随机分为6组，分别为模型组、益脉康5倍组、青光安2.5倍组、青光安5倍组、青光安10倍组和青光安20倍组。模型组灌服等量蒸馏水，益脉康5倍组按成人2.8g/kg剂量灌胃给予益脉康片,青光安颗粒2.5倍,5倍组,10倍组和20倍组4个剂量组分别按2.25,4.5,9,18g/kg剂量灌胃给予青光安颗粒，连续7d，1次/d。末次灌药后1h，颈主动脉取血，分离血清，所取血清经56℃，30min灭活处理后，用0.22μm的微孔膜过滤除菌，置20℃冰箱保存备用。人眼小梁细胞培养传代及细胞加压模型的建立:人小梁细胞（HTCs）复苏后, 加入适量含200mL/L胎牛血清的DMEM液, 放入CO2培养箱培养。待细胞贴壁后,每周换液2～3次, 细胞长满瓶底后, 用2.5g/L胰蛋白酶消化传代, 传至第5代开始进行体外加压。方法参照薛蔚[6]实验方法,取接近融合的人小梁细胞,用带“T”型三通管的橡皮塞塞紧培养瓶口，一端用注射器注入无菌空气加压,同时从与三通管相通的压力表中直接读取压力值,压力保持在60mmHg,加压24h。倒置显微镜下观察细胞形态并摄像,然后取一培养瓶细胞用2.5g/L胰蛋白酶消化,移入离心管中离心,加入25g/L戊二醛20g/L多聚甲醛混合液固定,经常规乙醇和丙酮逐级脱水,环氧树脂618包埋,LKBV超薄切片机切片,醋酸铀,枸橼酸铅双染后,行透射电子显微镜观察细胞超微结构。MTT法检测经不同含药血清作用不同时间后小梁细胞的增殖情况:取经过加压24h的小梁细胞，经2.5g/L蛋白酶消化后制成细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL,按每孔0.25mL接种于96孔培养板×3板,每个培养板分为7组,每组设6复孔,放入37℃,50mL/L CO2孵箱培养24h待细胞贴壁后 ,用Hanks液洗涤3次,随机分组进行实验, A组（空白组）:200g/L DMEM 250μL,B组（不含药大鼠血清组）不含药大鼠血清50mL＋200g/L DMEM 200μL,C组（益脉康5倍组）:50μL益脉康血清+200g/L DMEM 200μL,D,E,F,G组(青光安2.5倍组,5倍组,10倍组,20倍组):不同浓度青光安血清50μL+200g/L DMEM 200μL。3个培养板于37℃,50mL/L CO2孵箱中分别孵育12,24,36h后，凋零孔加Hanks液,其余各孔加入20μL MTT（5mg/mL）,于37℃培养4h ,吸净孔中的液体,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL ,充分震荡5min，使结晶物充分溶解,立即在酶标仪(λ= 490nm)单波长测定光密度(OD)值,以上步骤在相同条件下重复3次。
统计学分析：计量资料用均数±标准差（±s）表示。应用SPSS 14.0软件进行统计学处理，采用配伍组设计资料的方差分析和多重比较,检验水准为P<0.05。
2结果
2.1小梁细胞形态观察
倒置显微镜下观察细胞形态,可见体外培养的HTCs形态介于上皮细胞型和成纤维细胞型之间（图1），呈梭形、椭圆形、纺椎形和不规则形等，细胞突起较多，细胞融合后，突起消失。胞质丰富，常含有少许色素颗粒，胞核圆形或者椭圆形。细胞多在传代后12～24h开始贴壁生长,形态很快由圆形伸展成扁平状,细胞在48h后生长速度显著加快,72h后开始有细胞融合,一般均在1wk内完成融合,形成稳定的单层细胞层,细胞边缘紧密相连。
2.2小梁细胞体外加压后形态变化和其超微结构变化
人眼小梁细胞经过体外60mmHg加压24h后,倒置显微镜下可见部分细胞皱缩变圆,立体感减低,胞质内有少量空泡,细胞间隙加大,甚至有少许细胞浮起（图2）。透射电镜观察部分细胞超微结构轻微改变,表面微绒毛消失,部分细胞胞内脂滴及空泡增多,线粒体轻度肿胀,严重者细胞线粒体嵴肿胀,排列紊乱,甚至空泡化,粗面内质网扩张成泡状。
2.3不同浓度含药血清作用24h后小梁细胞生长状况
倒置显微镜下观察不同浓度含药血清作用24h后加压小梁细胞生长状况表明,空白组、不含药血清组小梁细胞数目较少,部分细胞收缩圆形,细胞间隙较大；青光安5倍组和益脉康5倍组比较小梁细胞数目和形态无明显区别；青光安10倍组和青光安20倍组小梁细胞数目均比前面4组小梁细胞数目要多,细胞排列紧密,胞体为梭形（图3）。表1不同药物与浓度含药血清作用12,24,36h后各组的OD值（略）
2.4各浓度含药血清组12,24,36h细胞的OD值(表1)
通过配伍组设计资料的方差分析,不同药物与浓度含药血清的F=41.642,P=0.000,故认为不同药物与浓度含药血清是OD值的影响因素;不同作用时间的F=20.994,P=0.000,故认为不同作用时间也是OD值的影响因素。进一步的多重比较结果显示:(1)5倍,10倍,20倍青光安血清组、5倍益脉康血清组与空白组两两比较,差异均有统计学意义（P=0.000）,而不含药血清组,2.5倍青光安血清组与空白组间差异均无统计学意义（P=0.660和P=0.330）;益脉康5倍与青光安5倍组两两比较,差异无统计学意义（P=0.771）,青光安10倍组、20倍组与青光安5倍组两两比较,差异均有统计学意义（P=0.000）;青光安10倍组与青光安20倍组两两比较,差异无统计学意义（P= 0.319）。（2）24,36h时间段与12h时间段两两比较,差异均有统计学意义(P=0.000）; 36h时间段与24h时间段两两比较,差异无统计学意义(P=0.323）。
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