作者：万超 陈蕾
作者单位：(110001) 中国辽宁省沈阳市，中国医科大学附属第一医院眼科
【摘要】目的：观察玻璃体腔内注射脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor，BDNF）前后STZ糖尿病大鼠视网膜中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的水平及多巴胺能无长突细胞数目的变化。
方法：9周龄Wistar大鼠，链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射，制成糖尿病模型，于模型建立2wk后，大鼠眼玻璃体内注射BDNF溶液，于模型建立4wk后，处死大鼠，取出眼球，取视网膜组织进行Western blotting及视网膜铺片免疫组织化学染色检测，观察视网膜中TH水平的变化，从而反映糖尿病大鼠视网膜中多巴胺能无长突细胞水平的变化。
结果：实验组糖尿病大鼠未注射BDNF眼视网膜中TH蛋白水平降低，多巴胺能无长突细胞计数及灰度低于对照组，均有统计学差异。实验组注射BDNF眼视网膜中TH蛋白水平、多巴胺能无长突细胞计数及灰度与对照组无统计学差异。
结论：在STZ糖尿病大鼠糖尿病早期，玻璃体腔内注射BDNF可提高视网膜中TH的水平，提高多巴胺能无长突细胞的数目。
【关键词】 Wistar大鼠 糖尿病视网膜病变 酪氨酸羟化酶 脑源性神经营养因子
Involvement of brain derived neurotrophic factor in early retinal neuropathy of diabetes in rats
Chao Wan, Lei Chen
Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Abstract AIM: To observe the changes of tyrosine hydroxylase (TH) protein levels and the density of dopaminergic amacrine cells before and after the administering brain derived neurotrophic factor (BDNF) protein into the vitreous cavities of streptozotocin (STZ) reduced Wistar diabetic rats.
METHODS: Adult male Wistar rats, 9 weeks of age, were injected intraperitoneally with STZ to create diabetes. At 2 week after the models were created, BDNF protein was administered into the vitreous cavities of rats. At 4 week after the models were created, the rats were killed and the retina was removed for Western blotting and Whole-mount immunohistochemistry for TH to observe the changes of TH and dopaminergic amacrine cells in retina.
RESULTS: The protein levels of TH, the number of positive staining dopaminergic amacrine cells and the staining gray scale of experimental group without BDNF were lower statistically. But there were no statistical differences between experimental group with BDNF and control group.
CONCLUSION: In the early stage of STZ diabetic, administering BDNF protein into the vitreous cavities can increase TH protein levels and the density of dopaminergic amacrine cells in the STZ rats' retina.
· KEYWORDS: Wistar rats; diabetic retinopathy; tyrosine hydroxylase; brain derived neurotrophic factor
0引言
传统的理论认为糖尿病视网膜病变属于微血管病变，但实际上它也是一种视网膜的神经变性类疾病。在人类和实验动物中，在糖尿病发生后不久，且在血管并发症出现之前，神经元内的分子功能就已经发生变化。糖尿病中视网膜的神经病变早于血管并发症出现，并贯穿糖尿病的始终，严重危害患者的视力。许多研究都表明脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）在视网膜生理和病理生理过程中具有重要作用[1,2]，本文报道在糖尿病大鼠玻璃体腔内注射BDNF前后视网膜中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的水平及多巴胺能无长突细胞数目的变化，旨在初步探讨糖尿病早期视网膜神经病变的发病机制。
1材料和方法
1.1材料 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），美国Sigma公司。TH免疫组化染色试剂盒，武汉Boster生物有限公司。BDNF冻干粉，美国Upstate公司。牛血清白蛋白（BSA），美国Sigma公司。平衡盐溶液（BSS），美国Alcon公司。中国医科大学实验动物部提供健康成年近交系9wk龄雄性Wistar大鼠60只，体质量180~220g，眼部经裂隙灯和检眼镜检查屈光间质清晰，眼底无病变。分笼饲养，标准颗粒饲料，不限食水。饲养场所通风良好，室温18~25℃，相对湿度40%~70%，12h光照昼夜循环。尿糖试纸，桂林中辉科技发展有限公司。血糖仪，血糖试纸，德国罗氏公司。
1.2方法
1.2.1STZ诱导糖尿病大鼠模型 枸橼酸盐溶液0.1mmol/L（pH4.5），高压灭菌，STZ浓度10g/L溶解于其中，使用前配制。大鼠禁食水12h，STZ 70mg/kg体质量腹腔注射。其后48h，72h，1wk连续3次采尾静脉血测空腹血糖，以空腹血糖高于16.7mmol/L为制模成功，且每周监测尿糖1次、每2wk监测血糖一次，将空腹血糖低于16.7mmol/L者剔除。
1.2.2动物的分组及处理 以成模鼠作为实验组，对照组腹腔注射同样剂量的枸橼酸盐溶液（每组30只）。大鼠成模后4wk，100g/L水合氯醛3ml/kg体质量腹腔注射全身麻醉后，摘除双侧眼球备用。颈椎脱位法处死大鼠。
1.2.3 BDNF的眼内注射 于STZ或安慰剂腹腔注射后2wk开始，每3d注射1次，共5次。BDNF冻干粉1g/L溶于含1g/L牛血清白蛋白（BSA）的平衡盐溶液（BSS）中。100g/L水合氯醛3mL/kg体质量腹腔注射全身麻醉，20g/L利多卡因1滴表面麻醉成功后，随机选取大鼠一侧眼球，用微量进样器取上述溶液5μL注射入大鼠眼玻璃体腔内，对侧眼注入同样剂量的含1g/L BSA的BSS溶液。将出现玻璃体出血或眼球萎缩者剔除。
1.2.4 Western blotting检测 检测TH的蛋白水平。将大鼠眼球置于显微镜下，去眼前节，小心分离出视网膜，将视网膜放入1mL EP管中，加入裂解液，冰上超声，4℃离心，取上清液，－70℃下保存，待检。酚试剂法蛋白定量，上样时确保每个样本的总蛋白量相同。大鼠抗-TH单克隆抗体（1:100倍稀释）作为一抗，兔抗鼠IgG抗体（1:100倍稀释）作为二抗。应用BandScan软件分析电泳条带的灰度值。
1.2.5视网膜铺片免疫组化检测 将视网膜固定，脱脂，在1g/L的PBS液中水合，将视网膜切成若干瓣，内界膜面向上，小心平铺在载玻片上。将标本放于含抗-TH单克隆抗体（1:100倍稀释），5g/L Triton X-100的PBS液中4℃下孵育72h，PBS洗后，置兔抗鼠IgG抗体(1:100倍稀释) 中4℃下孵育24h，PBS洗后，DAB显色。中性树胶封片后，置显微镜下观察。可分辨出多巴胺能无长突细胞。每张铺片计数5个高倍视野中标记的细胞数目即可得到TH阳性细胞的数目。
统计学处理：计数资料用均数±标准差（ ）表示，t 检验，使用SPSS 12.0数据分析软件包处理。
2结果
2.1实验组及对照组视网膜中的TH蛋白水平 TH蛋白水平用同一泳道的β-actin水平来标准化可见，实验组大鼠未注射BDNF眼TH蛋白灰度明显低于对侧眼和对照组眼P <0.01。而实验组大鼠注射BDNF眼、对照组注射与未注射BDNF眼TH蛋白水平无统计学差异（图1，表1）。
图1 实验组大鼠未注射(A)与注射BDNF眼(B)、对照组未注射(C)与注射BDNF眼(D)TH蛋白水平
2.2实验组及对照组视网膜中TH阳性细胞计数和染色灰度 实验组及对照组视网膜每张铺片分别计数5个高倍视野的TH阳性细胞数值，并取其平均值，实验组未注射BDNF眼的TH阳性细胞平均值明显低于对侧眼和对照组眼P <0.01。而实验组大鼠注射BDNF眼、对照组注射与未注射BDNF眼TH阳性细胞平均值无统计学差异（图2，表2）。实验组及对照组视网膜每张铺片分别计算5个高倍视野的TH阳性细胞的染色灰度值, 并取其平均值，实验组未注射BDNF眼的TH阳性细胞染色灰度平均值明显低于对侧眼和对照组眼P <0.05。而实验组大鼠注射BDNF眼、对照组注射与未注射BDNF眼TH阳性细胞的染色灰度平均值无统计学差异（表2）。
图2 实验组大鼠未注射BDNF眼(A)的TH阳性细胞平均值明显低于注射BDNF眼(B)
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