作者：王平宝，刘双珍，王 华，蒋晶晶，吴小影，谭星平，夏朝华

    【摘要】  目的：探讨雏鸡高度近视眼眼球后壁组织血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide ,VIP）mRNA的动态表达及意义。

    方法：选择出生1d来亨雏鸡共30只，15只右眼遮盖作为实验组，分别持续遮盖1，2和4wk;另15只双眼均未遮盖作为正常对照组。两组均采用检影验光检测屈光度;眼科A超测定活体眼轴长度；对两组3个时间段眼球后壁行RT-PCR检测VIPmRNA的动态表达。

    结果：实验组由实验前远视眼快速演变为高度近视眼，并随遮盖时间延长，近视度数加深，眼轴延长；两组眼球后壁均有VIPmRNA阳性表达；随出生时间延长两组VIPmRNA表达均逐渐增强。与对照组相比，实验组VIPmRNA表达明显上调（P<0.01）。

    结论：形觉剥夺可导致高度近视眼；高度近视眼较正常眼VIPmRNA表达明显上调。VIP可能参与了近视眼形成与发展的调控。

    【关键词】  形觉剥夺性近视眼

    0引言

    近视眼在普通人群中的患病率很高，全世界平均患病率为10%～40%；我国有3亿以上的近视眼，恶性近视眼约2 000万[1]。恶性近视眼是青壮年主要的致盲性眼病之一。由于对近视眼的发病机制不明，因此阐明近视眼的发病机制，从病因上治疗近视眼是眼科工作者亟待解决的关键问题。血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）是一种特殊的神经肽递质，具有神经递质、神经调质和神经自分泌等多种功能。作为视觉信息分子，VIP在视觉诱导近视眼形成的过程中可能起到视觉信息传递和调控的作用。目前关于VIPmRNA在形觉剥夺性近视眼（form deprivation myopia, FDM）中表达及作用如何，尚未见报道。为探讨VIPmRNA在FDM眼球后壁中的表达是否有改变，我们采用RT-PCR方法从核酸信息转录水平检测VIPmRNA在小鸡FDM动物模型中随形觉剥夺时间延长的动态表达。

    1材料和方法

    1.1材料  随机选择出生1d的健康黄色来亨雏鸡30只，雌雄不拘，眼部无充血及分泌物，裂隙灯及直接眼底镜检查屈光间质清晰。其中15只当日用半透明塑料眼罩（10mL塑料试管底部制作）单眼（右眼）遮盖作为实验组，遮盖时间为1，2，4wk，每周各5只雏鸡，建立不同时间段FDM动物模型；另15只雏鸡双眼均未遮盖作为正常对照组。饲养温度维持在20～25℃ ，光照与黑暗周期比为12h∶12h，专用雏鸡饲料、专人饲养。实验过程中眼罩脱落或遮盖欠佳的雏鸡被淘汰。分别于实验前、实验1，2，4wk，行双眼自然瞳孔下暗室视网膜检影验光，测量双眼屈光度数，由有经验的验光师专人检影；采用眼科A超测量4个时间段活体双眼眼轴长度，测量前，眼局部滴10g/L地卡因1次，每眼测量3次，取平均值，由专人测量。 分别于实验1，2，4wk，将不同时间段实验组和对照组各5只雏鸡断颈, 无菌快速摘除眼球，沿眼球赤道部切开，去除玻璃体，取其眼球后壁组织，快速标记并放入液氮中冷冻保存，后移入-70℃深低温冰箱中保存，RT-PCR备用。

    1.2方法

    1.2.1眼球后壁组织VIPmRNA的RT-PCR半定量检测  全部标本常规行眼球后壁组织总RNA的提取与逆转录合成cDNA；雏鸡VIP mRNA序列由美国生物信息中心（NCBI）提供的基因库（Genbank）中查找获得（基因序列号：VIP为NM205366），利用Primer5引物设计软件，根据mRNA序列设计高分值VIP引物序列（上海华大基因有限公司合成）；β-actin引物直接由北京鼎国生物公司提供。引物序列为:VIP引物:Forward Primer 5’tagaaatgcaaggcatgctg 3’, Reverse Primer 5’tttcgaaagcggctgtagtt3’,片段长度177 bp ; 内参照β-actin 引物: Forward Primer 5’ catctcttgctcgaagtcca 3’, Reverse Primer5’  atcatgtttgagaccttcaaca 3’, 片段长度310bp。反应条件：94℃5min→[94℃1min→55℃45s→72℃45s]×30cycles→72℃10min；反应体系相应试剂加入完全后，短暂离心，以25μL石蜡油覆盖；去离子亚沸水替代cDNA模板作为PCR扩增反应的空白阴性对照；取雏鸡小肠组织cDNA为模板作为阳性对照；以上均放入PCR热循环仪中进行扩增。

    1.2.2 RT-PCR扩增产物半定量  15g/L琼脂糖+ 0.5×TBE溶液配胶，0.5mg/L溴乙锭显色，6μL扩增产物+1μL6×溴酚兰buffer混匀点样，电压为100V，通电时间为20～30min，紫外线下观察PCR电泳结果。将凝胶放入Eagle Eye Ⅱ图像处理系统摄像并测量产物吸光度值（A值），并计算每个样本在同一个反应体系中与β-actin A值的相对比值，以便作统计分析。

    统计学处理：采用Statistica统计软件行方差齐性分析，在此基础上,两组之间比较用t检验，多组之间两两比较用q检验,直线相关分析，以P < 0.05为差异具有显著性，有统计学意义。

    2结果

    2.1眼屈光度数、眼轴长度与形觉剥夺时间相关分析  刚出生雏鸡均呈远视状态，眼轴短；随时间延长，对照组远视度数减低，眼轴延长，周龄与远视屈光度数呈负相关（r＝-0.88，P <0.01）；实验组眼屈光度由实验前远视快速演变为高度近视，眼轴明显增长，两者呈负相关（r＝-0.94, P <0.01）；两组之间实验前眼屈光度数、眼轴长度无明显差异（P   > 0.05）；但实验组形觉剥夺后，两组之间眼屈光度数、眼轴长度进行比较，有统计学差异（P <0.01，表1）。

    2.2逆转录聚合酶链反应结果  全部实验组和对照组雏鸡的眼球后壁组织提取的总RNA经15g/L琼脂糖电泳后，证实有28S，18S，5S三个清晰的电泳条带；紫外线分光光度计测定所有RNA的A260/280比值均在1.8～2.0之间；表明RNA既无降解，也无明显污染。雏鸡眼球后壁组织的VIPcDNA经RT-PCR后，产生一条分子质量为177bp电泳条带，而内对照β-actin产生一条分子质量为310bp电泳条带，经Eagle Eye Ⅱ图像处理系统摄像并测定VIP与β-actin光密度值（A）比较显示：对照组与实验组眼球后壁组织均有VIPmRNA表达；随出生时间延长，VIPmRNA表达逐渐增强。与正常对照组比较，实验组 VIPmRNA (P <0.01)表达明显上调（t   =15.892，16.278，21.480，P < 0.01，表2, 图1)。

    N:阴性对照; P:阳性对照; M:DNA分子质量Marker(100~      1 000bp)；A1,A2,A3为实验组实验1,2,4wk; B1,B2,B3为对照组实验1,2,4wk

    图1  眼球后壁组织VIPmRNA表达电泳结果

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