作者：牛超，惠延年，王雨生，张 鹏

    【摘要】  建立体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞脂褐素形成模型, 为研究RPE细胞衰老过程中细胞结构及功能的改变以及由于其衰老而引起的一系列年龄相关性眼病如年龄相关性黄斑变性奠定基础。

    方法：采用梯度离心法制备猪眼光感受器外节(POS)，将实验组RPE细胞与POS共培养3wk,在电镜下观察RPE细胞内脂褐素形成的形态学过程。

    结果：RPE细胞与猪POS共培养后，POS脱落的膜盘逐渐被RPE吞噬并崩解，板层小体在溶酶体内形成，随着培养时间的延长，板层小体的数量增多；对照组细胞培养相同时间后细胞器形态没有明显变化，仅有少量板层小体形成，实验组较对照组RPE细胞脂褐素含量明显增多。

    结论：将人RPE与猪POS共培养，促使了细胞内脂褐素的形成和蓄积，其过程周期短、操作简单、重复性强，可以作为体外培养的人RPE脂褐素形成模型。

    【关键词】  光感受器外节

    0引言

    脂褐素(lipofucin)是细胞衰老过程中出现的具有特征性的物质，其含量增加反应了细胞老化的程度[1]。视网膜色素上皮(RPE)细胞内脂褐素的增加可导致细胞结构及功能的改变，并引起一系列年龄相关性眼病如年龄相关性黄斑变性(AMD)[2]。增加培养细胞传代次数可复制RPE衰老[3]，但实验周期长，也不能体现出RPE吞噬光感受器外节(POS)脱落的膜盘导致其结构及功能的改变，以致衰老死亡的特性。为了在体外模拟这一过程，我们用制备的猪眼POS与人RPE共培养，建立人RPE细胞脂褐素形成模型。

    1材料和方法

    1.1材料  POS的制备参照Hall[4]的方法。从屠宰场刚处死的猪获取供体眼球，4℃湿房保存，4h内进行视网膜的分离。在超净台内将猪眼球用750mL/L酒精浸泡消毒5min，无菌处理后将眼球角膜向上置于眼球托上，自赤道部环形剪开眼球壁，体视显微镜下小心将视网膜分离取出，移入D-Hanks溶液配制的2.5g/L胰蛋白酶(美国Sigma公司)中。将视网膜组织在冰上进行消化并用磁力搅拌器搅拌15min。将消化后的溶液移入干净的试管中0℃静置10min，待大块的视网膜组织沉淀后取上清液以3 000r/min离心10min。离心后的沉淀用D-Hanks溶液漂洗并再次离心，反复操作2次，将收集到的POS计数并分散于100mL/L胎牛血清DMEM/F12培养液(Gibco公司)，调整为2×1010个/L，用光镜、透射电镜观察进行鉴定。

    1.2方法  采用胰蛋白酶消化法[5]体外培养的第2代人RPE细胞，以5×104个/L的密度接种于25mL培养瓶中，放在37℃，50mL/L CO2孵箱静置培养，次日更换培养液，以后隔天更换培养液，待细胞接近铺满时按1∶2进行传代并随机分为实验组和对照组。实验组细胞用含有POS的培养液培养3wk；对照组细胞用不含有POS的培养液在相同条件下培养相同的时间。将培养1，2，3wk的RPE用2.5g/L的胰蛋白酶消化，离心1 000r/min，5min×2次。弃去培养液，PBS溶液漂洗细胞3次，缓慢加入35g/L戊二醛，4℃过夜。送至电镜室，常规脱水，浸透，包埋，切片，染色，透射电镜观察和照相。

    2 结果

    2.1 POS的鉴定  倒置显微镜下观察，制备好的POS大小均一，形态类似，呈棒状均匀分布于培养液，其中散在少量细胞及杂质(图1A,B)。电子显微镜下观察，POS由胞质膜向内折叠构成了双层膜盘结构，除了与外节长轴相垂直的膜盘排列外，还可见到与外节长轴平行的膜盘以及斜形排列的膜盘(图2)。

    A:×100; B:×400

    图1倒置相差显微镜下制备的POS

    图2电子显微镜下制备的POS×25 000

    2.2RPE细胞脂褐素  透射电镜下观察对照组RPE的各细胞器清晰，游离核糖体丰富,分布均匀，粗面内质网排列规则，线粒体膜和嵴完整，高尔基体形态规整，核内染色质均匀。培养3wk以后，细胞内出现少量散在分布的电子密度均匀的均质小体和呈同心排列的板层小体，同文献报道的脂褐素的基本特征一致(图3)。实验组RPE用含有POS的培养液培养,电镜下可见尚未被吞噬的膜盘结构(图4A)以及正在被吞噬的膜盘(图4B)。3wk时可见核糖体颗粒模糊，分布紊乱；粗面内质网排列不规则，有膨胀和脱颗粒现象；线粒体数量减少，线粒体嵴断裂或消失；高尔基体扩张，形成低电子密度的空泡小体。细胞内出现大量高电子密度的均质小体和溶酶体，溶酶体内吞噬颗粒的周围形成多层次的板层结构(图4C)。均质小体和板层小体的数量较对照组细胞明显增多，且胞质内可见到尚未消化完全的膜盘结构(图4D)。

    图3 对照组RPE细胞可见少量脂褐素小体（箭头）TEM×10 000

    A: POS膜盘处于RPE细胞之间，尚未被吞噬TEM×        10 000；B: POS膜盘与RPE细胞接触，RPE胞膜表面内陷，将要吞噬膜盘TEM×15 000；C: 细胞内出现大量高电子密度的均质小体和溶酶体TEM×7 500；D: 胞质内尚未消化完全的POS膜盘结构TEM×15 000

    图4  吞噬制备的POS的RPE细胞脂褐素形成TEM

    3讨论

    正常人原代细胞经体外培养数代后最终都失去增殖活力，逐渐衰老死亡[6]。细胞衰老机制一直是人们研究的热点。脂褐素是一种脂质或蛋白质的聚合物，存在于不同组织有丝分裂后细胞的溶酶体内,它是溶酶体对细胞内结构或功能不健全的亚细胞成分进行自体吞噬后形成的残余物质，并随着年龄的增加而增多，因此又被称为“衰老色素”或“衰老标志”，它是整个细胞功能下降的一种生物学指标。对于RPE来说，脂褐素的形成则是由于RPE不断吞噬POS末端不断脱落的膜盘造成的。脂褐素作为被吞噬膜盘的不完全降解物堆积在RPE内，长期的堆积将严重影响细胞的功能，造成RPE的衰老及凋亡，进而引起一系列年龄相关性眼病如AMD的发生。据统计，一个80岁老人RPE中脂褐素的体积最终会占到胞质容积的19％[7]。因此，如果能在实验条件下使细胞内堆积脂褐素，找到一些重复性强的实验途径，成功的在年轻个体中形成脂褐素，甚至使细胞的寿命有所改变，那就会在解决脂褐素同衰老过程的关系问题上获得更多的线索。我们对培养的RPE内脂褐素的含量变化进行了观察，以脂褐素含量的增多作为细胞衰老的指标。

    我们将预先制备好的猪眼POS与人RPE共培养，用电镜记录细胞内脂褐素形成的过程。通过电子显微镜观察，Nunomura等[8]将脂褐素分为3型：I型由电子密度稍高的细微颗粒组成，可能含有空泡，即空泡小体；II型为均质无构造的团块，即均质小体；III型为板层结构，即板层小体。Heinsen[9]描述小脑脂褐素由3种成分组成：①小滴状均一的电子透明区；②颗粒状基质；③强嗜哦性小区。这三部分所占比例因细胞类型而异。在本实验中，对照组RPE培养3wk以后，细胞内出现少量散在分布的电子密度均匀的均质小体和呈同心排列的板层小体，其余细胞器结构并未发生较大变化，实验组细胞与POS共培养后出现细胞内脂褐素大量沉积，各种细胞器变性、分解，胞质内尚可见到未消化完全的膜盘结构。因此我们考虑对照组RPE细胞脂褐素的出现主要是由于年龄的内在因素造成脂褐素沉积，是溶酶体对细胞内结构或功能不健全的亚细胞成分进行自体吞噬后形成的，并不是实验处理使然。实验组细胞与POS共培养后出现细胞的变化与正常人RPE衰老后的改变极为相似，虽然其中也会存在因溶酶体自吞噬造成的脂褐素增多，但是与对照组相比，两组脂褐素含量的变化具有显著差异，因此我们认为造成该差异的原因主要是由于RPE吞噬POS引起的，这与体内RPE衰老后出现的脂褐素增多过程相一致。

    将制备好的猪眼POS与人RPE共培养，可以引起RPE因吞噬POS而造成的细胞内脂褐素的增多，模拟了人体内正常RPE的吞噬及衰老过程，因此可作为良好的RPE脂褐素形成的实验研究模型，为研究年龄相关性黄斑变性的发病机制奠定了基础。

    【参考文献】

    1 Terman A, Brunk UT. Lipofuscin. Int J Biochem Cell Biol ,2004;36:1400-1404

    2 Boulton M, Dayhaw-Barker P. The role of the retinal pigment epithelium: topographical variation and ageing changes.Eye ,2001;15:384-389

    3韩泉洪,贾洪真,郭长梅,王静波,张鹏,崔志利,惠延年.培养人视网膜色素上皮细胞中β一半乳糖苷酶活性研究.眼科研究,2004;22:456-458

    4 Hall MO. Phagocytosis of light-and dark-adapted rod outer segments by cultured pigment epithelium. Science ,1978;202:526-528

    5王雨生,严密,杨抚华.视网膜色素上皮细胞培养技术及其应用.中华眼底病杂志,1994;10:124-128

    6徐国兴,杨娟,孙堂胜,胡建章,谢茂松,郭健.体外原代培养人视网膜色素上皮细胞.国际眼科杂志,2004;4(1):12-15

    7 Feeney-Burns L, Hilderbrand E, Eldridge S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular,equatorial and peripheral cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1984;25:195-200

    8 Nunomura A, Miyagishi T. Ultrastructural observations on neuronal lipofuscin (age pigment) and dense bodies induced by a proteinase inhibitor, leupeptin, in rat hippocampus. Acta Neuropathol (Berl) ,1993;86:319-328

    9 Heinsen H. Lipofuscin in the cerebellar cortex of albino rats: an electron microscopic study. Anat Embryol (Berl) ,1979;155:333-345