作者：刘勇，王恩普，李 丹，刘 兵，耿 惠，孙永华

    【摘要】  观察人Kringle1-5（K1-5）蛋白滴眼液来观察其抑制角膜新生血管的效果。

    方法：随机将缝线法诱导单侧角膜新生血管的28只新西兰白兔分为两组。K1-5组给予人K1-5蛋白滴眼液点眼，PBS组给予PBS液点眼。观察两组角膜新生血管形成时间、最长新生血管、新生血管面积并进行统计学分析。随机选择处死实验兔，取下角膜组织进行病理检查。

    结果：K1-5组最早于3d，平均3.50±0.52d可见新生血管芽进入角膜缘，9～15d新生血管生长最为旺盛；20d时最长新生血管为4.38±0.27mm，新生血管面积27.51±4.19mm2。而对照组最早于2d，平均2.28±0.47d可见新生血管芽进入角膜缘，4～10d时新生血管生长最为旺盛；至20d时新生血管最长为7.33±0.46mm，新生血管面积为38.96±4.11mm2。两组角膜新生血管出现时间、最长新生血管、新生血管面积方面均具有统计学差异（P ＜0.01）。在不同时段里K1-5组角膜基质层缝线周围新生血管较少，局部有少量浆细胞及成纤维细胞；PBS组新生血管较多，局部有较多浆细胞、淋巴细胞、成纤维细胞。K1-5组在不同时段里角膜组织中VEGF121阳性表达少于PBS组。

    结论：人K1-5蛋白点眼能够抑制缝线法诱导的角膜新生血管形成和生长。

    【关键词】  角膜新生血管

    0 引言

    角膜新生血管（corneal neovascularization）是常见的角膜疾病，可以由外伤、手术、感染、毒素、营养不良等诸多因素引起[1]。Kringle1-5（K1-5）蛋白作为纤溶酶原的降解产物，具有特异性抑制血管内皮生长作用，目前一些体内外试验已证实其能抑制新生血管的生长，但在局部点眼抑制角膜新生血管的报道较少[2]。

    1材料和方法

    1.1材料  健康成年的新西兰白兔28只，体质量2.2～3.4kg，雄性10只，雌性18只，均由空军总医院实验动物中心提供。裂隙灯下观察双眼结膜角膜正常。随机确定每只兔实验眼。氯胺酮10mg/kg+速眠新0.2mg/kg sc麻醉，麻醉生效后，实验眼2.5g/L氯霉素眼液清洁点眼，5g/L地卡因表面麻醉。放置开睑器后，于角膜缘内1.5mm处板层置5-0丝线3根，间距为1.5mm，缝线埋于角膜基质内5mm，角膜面留1mm线头。将角膜缝线处理过的新西兰白兔运用计算机随机数字法进行分组，分为K1-5组和PBS组，每组各14只。参考Cao等[2]实验结果并结合预实验结果，对于K1-5组的实验眼给予配好的1.5mg/L的K1-5蛋白滴眼液[配制方法为无菌条件下将150μg人K1-5蛋白（购于美国Alpha公司）溶于100mL PBS液中，并在4℃冰箱保存]，4次/d；PBS的实验眼给予PBS液。4次/d。28只兔同时给予2.5g/L氯霉素眼液点眼预防感染，4次/d。

    1.2方法  每日裂隙灯观察角膜新生血管的长度，数目以及角膜水肿情况；并按照公式A =C/12×3.1416[r 2-(r -l)2] [3]计算新生血管面积（C为新生血管所占角膜圆周的钟点数，r为角膜半径，l为深入角膜中央的最长血管。术后1，3，5，7，10，13，15，17，20d对实验眼拍照。二组分别在缝线后5，10d随机各处死3只实验兔，取下角膜组织送病理；缝线后20d处死剩余实验兔，随机选择其中3只送病理。取上述实验兔角膜组织，立即用40g/L甲醛液固定，2wk后每一标本经石蜡包埋、编号。分别进行HE染色以及免疫组织化学染色。采用EliVisionTMplus免疫组织化学染色盒（中国福建迈新生物技术开发公司）进行染色。其中一抗为人抗鼠/兔VEGF121Ab-3（美国Labvision公司），染色过程中加入内源性过氧化酶阻断剂，二抗为酶标羊抗鼠/兔聚合物（中国福建迈新生物技术开发公司），DAB显色液，阳性显色为棕褐色；每次染色时均用PBS代替一抗作为阴性对照。

    统计学处理：对二组新生血管出现时间、不同时段角膜最长新生血管长度及新生血管面积进行统计分析，正态分布数据用x±s，并作二组独立样本均数t检验分析。所使用软件为SPSS12.0数据统计分析系统。

    2结果

    2.1角膜新生血管  制备角膜缝线后PBS组最早于2d，平均时间2.28±0.47d可见新生血管芽深入角膜缘，4～10d时生长最为旺盛，20d可以观察到最长新生血管为7.33±0.46mm，平均面积为38.96±4.11mm2。新生血管粗大、密集成堆，不易分辨；缝线周围角膜中度水肿。K1-5组角膜最早于3d，平均时间是3.50±0.52d可见新生血管芽进入角膜缘，9～15d新生血管生长最为旺盛，16～20d趋于缓慢，20d观察到新生血管较细、稀疏，缝线周围角膜轻度水肿（图1A，B）。两组角膜新生血管出现时间有统计学意义（F＝16.00，P＝0.000）。二组不同时段最长新生血管长度以及新生血管面积比较均有统计学意义（P＜0.01，表1）。

    2.2组织病理学  缝线后5，10及20d K1-5组角膜基质层缝线周围新生血管少，浆细胞及成纤维细胞较少，炎症反应较轻。PBS组角膜基质层新生血管多，管腔大，有大量浆细胞、淋巴细胞及成纤维细胞，炎性反应较重（图2A，B）。缝线后5，10及20d，在K1-5组角膜组织切片中可见以血管内皮细胞为主的细胞胞质内血管内皮生长因子（VEGF121）阳性表达较少；而PBS组角膜组织切片中VEGF121阳性表达较多（图3A，B）。

    A K1-5组;B  PBS组

    图1  角膜缝线术20d×16

    A K1-5组;B PBS组

    图2  角膜缝线术20d HE×100

    A:K1-5组;B:PBS组

    图3  角膜缝线术20d VEGF121染色×200

    3讨论

    角膜在正常生理状态下是没有血管的，但是各种导致角膜缘屏障破坏的病因都可以诱导角膜新生血管化[1]。角膜新生血管化不仅是致盲的重要原因之一，亦是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素。新生血管化的植床既能增加术后的排斥反应率，又降低植片的存活率，并且新生血管的数量与术后排斥反应率呈正相关。因此采取有效措施抑制角膜新生血管的形成和生长，是减少角膜移植排斥的重要措施之一[4,5]。我们首先建立起兔角膜新生血管的模型。在以往研究中建立角膜新生血管模型的方法较多。常用的有酸碱化学烧灼法，这种方法取材简单、操作方便，可以良好地诱导出角膜新生血管，并且角膜新生血管的形成、生长情况确切；但存在有烧灼范围、烧灼深度等方面不易控制的问题[6]。另一种较为常用的方法是角膜微袋内植入化学颗粒来诱导新生血管，这种方法诱导出的新生血管生长定向性好，个体间差异性小；但存在使用的器械特殊、药物配制及包埋过程较为复杂等不利因素 [7]。我们采用角膜缝线法建立角膜新生血管模型。与以上两种方法比较，诱导的新生血管形成理想，且在形成时间、生长速度、生长方向等方面个体间差异小，易于比较，同时材料简单，操作容易[8]。在本实验研究中以PBS组结果作为模型的参照，此组诱导出的兔角膜新生血管与Holzer等[9]研究结果类似，且个体间差异性较小。因此本研究中对所建立的角膜新生血管模型评价是满意的。

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