作者：王静波 作者单位：解放军总医院第309临床部 眼科，北京 100091
【摘要】 目的 观察前囊膜划伤对小鼠晶状体上皮细胞早期生长反应因子-1（early growth response factor-1，Egr-1）表达的影响。方法 36只成年雄性昆明小鼠，随机分为6组，制作小鼠晶状体前囊膜划伤模型。采用Western blot和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）观察前囊膜划伤后不同时间（0，0.5，0.75，1，2，5 h）晶状体上皮细胞Egr-1蛋白和mRNA的表达变化。结果 在正常未划伤的晶状体上皮细胞，Egr-1 mRNA低表达，划伤后0.5 h表达即增强，并在2 h时达到峰值，随后逐渐减弱。正常未划伤的晶状体上皮细胞 Egr-1蛋白表达微弱，划伤后0.5 h，Egr-1蛋白表达即显著增强，并在2 h时达到峰值，随后开始减弱。结论 前囊膜划伤可诱导小鼠晶状体上皮细胞Egr-1 mRNA和蛋白的表达。
【关键词】 晶状体 皮细胞 伤 期生长反应因子-1
在前房或虹膜与晶状体前表面的后房内植入人工晶状体可纠正超高度近视，但临床上观察到该手术可诱发白内障，因为人工晶状体的植入虽然不会对前囊膜造成破损，却会对晶状体上皮细胞产生一定的刺激[1]。
Shirai等[1]观察到，大鼠晶状体前囊膜的划伤会诱导划伤处和赤道部晶状体上皮细胞c-fos的表达，提示对前囊膜轻微的机械刺激可激活晶状体上皮细胞的转录活性，但轻微机械刺激对晶状体上皮细胞的其他早期基因的作用尚不完全清楚。
早期生长反应因子-1（early growth response factor-1，Egr-1）为一重要的核转录因子，属于即刻早期反应基因家族。Egr-1在受到一些广泛的细胞外刺激（如机械损伤、细胞因子、氧化损伤等）后可出现快速而短暂的表达，从而调控细胞的增生、分化及凋亡[2]。在本实验中，我们将研究晶状体前囊膜的轻微划伤对晶状体上皮细胞Egr-1表达的影响，从而明确Egr-1在晶状体上皮细胞划伤后的早期作用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 II级雄性昆明小鼠36只，体重（25±5）g，12周龄。将昆明小鼠随机分为6组，各组随机选取左眼或右眼为实验眼别，每组6只。
1.1.2 实验试剂 Trizol（Invitrogen公司），反转录试剂盒（Promega公司），Taq酶（MBI公司），兔抗鼠 Egr-1多克隆抗体、兔抗鼠β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（武汉博士德公司），辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（北京中杉公司），免疫印迹化学发光 （ECL）试剂盒（北京天为时代），聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Millipore公司）。Egr-1引物，上游5′ AACGACAGCAGTCCCATTTACT 3′，下游5′ ATAGTAGACAGAGGGGTTAGCGAAG 3′ [317碱基对（bp）]；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）引物，上游5′ TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′，下游5′ ACCACAGTCCATGCCATCAC 3′（450 bp）（引物由上海生工合成）。
1.2 方法
1.2.1 晶状体前囊膜划伤模型的制作 昆明小鼠麻醉后，参考Shirai等[1]的方法制作晶状体前囊膜划伤模型，弃去前囊膜划破的小鼠。具体步骤如下：小鼠麻醉后，做透明角膜切口，前房用玻璃酸钠充满，经角膜切口将25 G的钝注水针头送入前房，在晶状体前囊膜的中央区轻轻地上下划10次，不划破囊膜。分别在划伤后0，0.5，0.75，1，2，5 h以颈椎脱臼法处死小鼠，摘除眼球，剔除周围组织，从后极部取出晶状体，完整剪出囊膜并以磷酸盐缓冲液轻柔冲洗1次，以备行RNA或蛋白质的提取。
1.2.2 半定量RT-PCR检测Egr-1 mRNA的表达
组织准备充分后，按Trizol操作说明，提取总RNA，逆转录合成cDNA第1链，产物进行PCR反应。反应参数94℃，45 s，退火1 min，72℃，1 min。退火温度分别为：Egr-1，62℃，1 min；G3PDH，60℃，1 min。Egr-1反应为35个循环，G3PDH反应为30个循环。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察照相。采用Kodak Digital Science 1D分析软件分别读取各片段灰度值，以Egr-1灰度值与G3PDH灰度值的比值代表Egr-1 mRNA的水平。
1.2.3 Western blot检测Egr-1蛋白的表达 组织准备充分后以裂解液提取蛋白质，将样品于100℃水浴8 min。取等量蛋白上样进行10％十二烷基硫酸钠凝胶电泳，电泳毕，将蛋白转移至PVDF膜上，丽春红S 染色，5%的脱脂奶粉4℃封闭过夜，加一抗37℃孵育1 h，洗涤，加二抗37℃孵育1 h，洗涤，加ECL化学发光试剂，胶片曝光显影。X光片扫描后，用Kodak Digital Science 1D分析软件进行条带灰度分析，以Egr-1的灰度值与β-actin灰度值的比值代表Egr-1蛋白的水平。
1.3 统计学方法 用SPSS 13.0统计分析软件对各组数据进行t检验分析，绘图采用Origin 7.0软件。
2 结果
2.1 划伤诱导晶状体上皮细胞Egr-1 mRNA的表达 正常未划伤的小鼠晶状体上皮细胞Egr-1 mRNA表达水平低，划伤后0.5 h，Egr-1 mRNA表达即增强，并逐渐升高，1 h时略有减低，随后表达渐增强，并在划伤后2 h达到峰值，之后开始减弱（见图 1，表1）。
2.2 划伤增强晶状体上皮细胞Egr-1蛋白的表达
在正常未划伤的小鼠晶状体上皮细胞中，Egr-1蛋白仅有微弱表达，划伤刺激后0.5 h，Egr-1蛋白表达即显著增强，与Egr-1 mRNA的表达一致，Egr-1蛋白表达在划伤后2 h达到峰值，之后表达开始减弱（见图 2，表1）。
3 讨论
Egr-1属即刻早期基因家族，是一重要的早期转录因子[2-3]。细胞中的即刻早期基因能介导细胞的生长与分化，当细胞受到生长因子、离子射线、细胞因子等刺激引起膜去极化时，本来处于休眠状态的即刻早期基因很快被激活，导致细胞的增殖，对细胞生长分化和损伤修复起重要作用。
本实验观察到，未划破前囊膜的轻微划伤在短时间内可诱导小鼠晶状体上皮细胞Egr-1蛋白和mRNA的表达，提示对前囊膜的机械刺激可快速激活晶状体上皮细胞的转录活性。活化的Egr-1与靶基因启动子上特异结合位点作用而调控不同靶基因的转录。目前已证实至少有30多种基因的转录需要Egr-1参与，包括与细胞生长分化和细胞凋亡、炎性细胞趋化、免疫刺激等相关的多种基因[3]。Egr-1的生物学功能主要是通过激活或抑制这些靶基因的表达实现的。Egr-1对同一基因在不同类型细胞中表达的调控效应也可不同。目前推测Egr-1对靶基因的调控作用与下列因素有关：?譹?訛细胞类型。?譺?訛靶基因种类。?譻?訛靶基因启动子上Egr-1结合位点的数量、相对位置，靶基因启动子与多个转录因子等的相互作用能力。?譼?訛Egr-1磷酸化状态影响其与DNA及蛋白结合能力。但Egr-1的活化究竟可调控晶状体上皮细胞的哪些基因的转录，这些基因的转录对上皮细胞生物学性状的影响等问题还需要深入的研究。
我们的实验发现，在划伤后1 h，Egr-1 mRNA的表达较0.75 h时略有减低，随后表达又升高。Egr-1表达的升高，是因为刺激引起细胞膜去极化，激活了Egr-1基因[2]。Egr-1表达的减低，可能是因为Egr-1蛋白通过与Egr-1基因启动子区域相结合而下调自身的表达，这是一种自身调节的作用[4-5]。
在晶状体中，Egr-1表达的升高可能与晶状体细胞的损害有关[6]。在紫外线照射[7]和硒诱导的白内障模型[6]中，Egr-1的表达上调。在过氧化氢刺激后，人晶状体上皮细胞系CD5A细胞Egr-1蛋白的表达增加[8]。研究表明，一些DNA损伤的因素，如离子和紫外线照射，可诱导Egr-1的表达[9-10]。与这些结果一致，我们的研究观察到，晶状体前囊膜的轻微划伤可在短期内诱导晶状体上皮细胞Egr-1的快速表达，这提示轻微的机械划伤可引起晶状体上皮细胞的损害。
研究者观察到，如植入的人工晶状体在睫状沟内不稳定，它可通过刺激晶状体上皮细胞转化为间质细胞，从而引起前囊膜下白内障的形成[11-12]。研究认为，后发性白内障的形成是白内障摘除过程中晶状体上皮细胞对创伤的一种应激反应，创伤引起细胞的某些分子的表达发生变化。一方面，失去皮质的压力，晶状体上皮细胞失去单层性，并加速向成纤维细胞转化[13]；另一方面，白内障摘除过程中水流的剪切力对残留的晶状体上皮细胞的机械刺激也非常大。我们分析，轻微的机械刺激活化了晶状体上皮细胞的Egr-1基因，Egr-1又通过多种途径调控其多种靶基因，从而引起晶状体上皮细胞的转化，并可能在随后的白内障的形成中起一定的作用。但Egr-1在这些病变中的具体作用及其机理还需要进一步详尽的研究。
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