作者：生晖    作者单位：复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 眼科，上海 200031

    【摘要】  目的 探讨蓝光滤过型人工晶状体（intraocular lens，IOL）对含N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺（A2E）的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞的细胞活力、氧化应激及分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）的影响。方法 体外培养含A2E的RPE细胞，用低强度蓝光持续照射，在光通路上置蓝光滤过型（AcrySof Natural）或紫外线阻挡型（AcrySof ）IOL。细胞分为：A组（AcrySof Natural IOL，光照）；B组（AcrySof IOL，光照）；C组（光照，无IOL）；D组（无光照，无IOL）。CCK-8检测细胞活力，流式细胞仪检测活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）水平，酶联免疫吸附法检测还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、VEGF、PEDF含量。结果 A、B、C和D组细胞活力分别为（76.9±3.9）％、（42.5±4.3）％、（35.2±4.1）%、（96.7±3.1）%；ROS分别为511.53±67.43、1011.15±174.88、1022.23±158.72、452.82±77.98；GSH分别为（15.34±4.77）μmol/L、（2.57±1.96）μmol/L、（1.58±1.13）μmol/L、（19.73±5.49）μmol/L；VEGF/PEDF比值分别为1.40、9.76、14.86、0.71。同B、C组相比，A组细胞活力和GSH含量明显提高，ROS含量和VEGF/PEDF比值明显下降（P<0.05）。结论 蓝光滤过型IOL对A2E介导的RPE细胞蓝光损伤有保护作用，能够降低蓝光诱导的ROS和VEGF水平，优于紫外线阻挡型IOL。

    【关键词】  视网膜色素上皮 维生素A酸类 光 晶 人工 年龄相关性黄斑变性

    年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）随年龄增加发病率逐渐上升，并可导致视力不可逆性下降。脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是渗出型AMD的特征，而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）之间的平衡失调是CNV形成的重要机制。

    白内障摘除透明人工晶状体（intraocular lenses，IOL）植入术后，大量蓝光进入眼内，造成视网膜蓝光损伤。本研究通过体外培养人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞，建立蓝光损伤模型，探讨蓝光及蓝光滤过型IOL对RPE细胞的细胞活力、氧化应激以及分泌VEGF、PEDF的影响。

    1  材料和方法

    1.1  RPE细胞培养  眼球来自复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼库，为角膜移植术后的供体眼球。剪除眼球外附着的肌肉和筋膜组织，用无菌生理盐水(含庆大霉素100×103 U/L)冲洗后置于冰盒内，12 h内用于实验。参照文献[1]报道方法培养RPE细胞，待细胞融合后做传代培养，取第4～第6代细胞用于实验。使用角蛋白和波形蛋白免疫细胞化学染色法对培养细胞进行鉴定，RPE细胞角蛋白染色强阳性，波形蛋白染色弱阳性(SABC法，DAB显色)。

    1.2  N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺（N-retinylidene-N-retinylethanolamine，A2E）[2]体外合成及RPE细胞对A2E的摄取  全反式视黄醛（100 mg，352 ?滋mol）和乙醇胺（9.5 mg，155 ?滋mol）（Sigma，USA）混合，溶解于3.0 ml乙醇中，再加入9.3 ?滋l（155 ?滋mol）醋酸，室温下搅拌，密封后置于暗处2 d。混合物在真空中离心，残渣用硅凝胶柱层析法纯化。(MeOH)：CH2Cl2（5：95）洗脱。(MeOH)：CH2Cl2：三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（8：92：0.001）再次洗脱后获得A2E。

    采用HP1100型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（美国安捷伦公司）获得纯化的A2E，反应条件如下：色谱柱：Cosmosil C18，4.6×150 mm；流动相：水/甲醇（85%~96％，含0.1%TFA），20 min；流速：1.0 ml/min；检测波长：430 nm。经HPLC纯化后的A2E溶解于甲醇中（约40 ?滋mol/L）。溶液置于室温、室内光线下  20 min。HPLC分析A2E的异构化程度（反应条件同上）。

    A2E合成后，溶解于DMSO（dimethyl sulfoxide）中，调整A2E浓度为25 mmol/L，储存于－20℃的暗处。实验前，取出储存的A2E溶液，加入RPE细胞培养液中，使A2E的终浓度为25 ?滋mol/L，将RPE细胞置于37℃、5％ CO2培养箱中孵育2 h后，置于荧光显微镜下观察A2E自发荧光，使用异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate，FITC)激发荧光（激发波长460～550 nm，发射波长510～560 nm），激发时间≤2 s。对照组RPE细胞不加入A2E。

    1.3  光照模型　　卤素灯发出的光，透过蓝色[（450±9）nm]干涉滤光片（上海海光光学元件厂）作为光源，光照时间为60 h，细胞平面光照强度为2W/m2，细胞培养液中加入A2E以及从培养箱中取出和放入等操作时，周围光照强度约为10 Lux（ZDS-10型照度计，上海嘉定学联仪表厂）。光照时，用电子温度计监测细胞平面温度变化在36.5~37.2℃。用环钻切取IOL中央光学区，放在培养孔的上表面，位于光束的中心。蓝光滤过型IOL为Alcon AcrySof?誖 Natural（SN60AT）（20.0 D，6.0 mm光学直径），紫外线阻挡型IOL为Alcon AcrySof?誖（SA60AT）（20.0 D，6.0 mm光学直径）。细胞分组如下：A组，光束中央放置AcrySof Natural IOL，接受蓝光照射；B组，光束中央放置AcrySof IOL，接受蓝光照射；C组，光束中央不放置IOL，接受蓝光照射；D组：细胞用铝箔覆盖，不接受光照，不放置IOL，其他条件同上。

    1.4  细胞活力分析  接种100 μl RPE细胞悬液（5000个细胞/孔）于96孔板内。预先在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱内培养。另准备几个孔并接种已知数量的活细胞来进行标定。在孔板内加入A2E，使A2E浓度为25 ?滋mol/L。在培养箱内培养 2 h后，蓝光照射，然后在每个孔内加入10 μl的CCK-8试剂（Dojindo Molecular Technologies Inc.， Japan），培养板放在培养箱内继续培养2 h。用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（A）值，参比波长为600 nm。计算细胞生存率(%)：细胞生存率(%)=处理组活细胞A值/对照组活细胞A值×100%。实验重复3次，取平均值。

    1.5  流式细胞仪检测活性氧自由基水平  双氢－乙酰乙酸二氯荧光黄（2’，7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2-DCFH-DA)(Sigma，USA)为活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）探针，在细胞内被氧化成可发出荧光的二氯荧光黄（DCF），DCF 的荧光强度即代表细胞的ROS水平。收集RPE细胞，PBS漂洗后加入H2-DCFH-DA 1 μg/mL，37℃孵育15 min后以流式细胞仪检测(FACScan，B&D，USA)。

    1.6  还原型谷胱甘肽含量测定  收集RPE细胞，离心弃杂质，冰PBS漂洗，加入10 mM HCl，再加入5% SSA，离心半径8 cm，1500 r/min离心10 min，取上清液，按照还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量检测试剂盒(Dojindo Molecular Technologies Inc.， Japan)说明进行操作，酶标仪（Thermomultiskan MK3型）405 nm 波长读取吸光度（A）值，绘制标准曲线，查出相应GSH浓度。

    1.7  VEGF和PEDF测定  用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）测定RPE细胞培养液上清液中VEGF和PEDF的含量。待RPE细胞生长融合接近80％时，弃上清液，加入无血清培养液，继续培养24 h。光照后，收集培养液，离心半径8 cm，1500 r/min离心10 min，取上清液，按照人VEGF、PEDF的ELISA试剂盒（Quantikine R&D Systems，USA）说明进行操作。酶标仪（Thermomultiskan MK3型）450 nm波长读取吸光度（A）值，绘制标准曲线，查出相应VEGF和PEDF浓度。

    1.8  统计学方法  实验重复3次，利用SPSS 10.0统计分析软件，采用配对t检验分析结果。P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  A2E合成及人RPE细胞对A2E的摄取  100 mg全反式视黄醛和9.5 mg乙醇胺在体外合成53.8 mg A2E（76.3 ?滋mol）。体外合成并经纯化后的A2E溶解于甲醇（40 ?滋mol/L），在室温、室内光线下暴露20 min后，HPLC分析A2E的异构化程度，形成A2E：iso-A2E＝4：1的平衡状态。A2E加入RPE细胞培养液中，孵育2 h后，在荧光显微镜下可见A2E黄绿色自发荧光，主要分布于RPE的细胞核周围。自发荧光2 s以后逐渐淬灭（见图1）。对照组RPE细胞中没有加入A2E，没有观察到自发荧光。

    2.2  细胞活力分析  A、B、C和D组细胞活力分别为（76.9±3.9）％、（42.5±4.3）％、（35.2±4.1）%、（96.7±3.1）%。B组和D组、C组和D组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；A组和D组、B组和C组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

    2.3  ROS和GSH含量检测 　A、B、C、D组的ROS和GSH水平见表1。同D组相比，A组的ROS水 平上升和GSH水平下降的变化差异无统计学意义（P>0.05），而B组和C组的ROS水平明显升高，同时GSH水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。A组与B组、A组与C组之间的ROS及GSH水平差异均有统计学意义（P<0.05），B组与C组间ROS及GSH水平差异无统计学意义（P>0.05）。

    2.4  VEGF和PEDF含量检测  A、B、C、D组的VEGF和PEDF含量及VEGF和PEDF含量的比值见表2。同D组相比，A组的VEGF浓度上升和PEDF浓度下降的变化差异无统计学意义（P>0.05），而B组和C组的VEGF浓度明显升高，同时PEDF浓度明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。A组与B组、A组与C组之间的VEGF浓度上升和PEDF浓度下降差异均有统计学意义（P<0.05），B组与C组间VEGF和PEDF浓度变化差异无统计学意义（P>0.05）。

    3  讨论

    白内障手术与晚期AMD相关的临床资料提示蓝光暴露与渗出型AMD的发生发展有关[3]。本研究结果证实蓝光对RPE细胞有损伤作用，含有A2E的RPE细胞受持续低强度蓝光照射后，细胞活力下降、ROS含量增加、GSH含量降低、VEGF分泌量上调而PEDF分泌量下调，而蓝光滤过型IOL能够减轻光损伤，明显降低ROS和VEGF含量。

    在该研究中，用低强度蓝光持续照射含有A2E的RPE细胞，并观察蓝光滤过型IOL和紫外线阻挡型IOL的保护作用，结果发现蓝光滤过型IOL能明显提高RPE细胞的细胞活力。有报道蓝光滤过型IOL (Alcon AcrySof?誖 Natural，SN60AT) 对RPE细胞蓝光、绿光和白光照射有保护作用[4]；还有研究者发现黄色IOL（YA60BB， Hoya）同传统的紫外线阻挡型IOL相比，能降低白光对含A2E的RPE细胞的损伤[5]。这些实验在设计方案上存在差异，但结果都证实了蓝光滤过型IOL对RPE细胞有保护作用。

    本研究发现，蓝光照射含有A2E的RPE细胞后，细胞产生大量的ROS，GSH水平明显下降。光氧化反应是ROS的主要来源，蓝光导致RPE细胞光化学损伤的机制还不完全清楚，而ROS可能是蓝光损伤的介导物。RPE细胞摄取A2E后暴露于短时间高强度蓝光，发生细胞凋亡[4，6]。本研究用低强度蓝光持续照射，同时观察到细胞活力下降，VEGF分泌增加。短时间高强度光照会导致细胞凋亡，而低强度持续照射时，对细胞产生氧化应激，细胞启动防御机制。急性高强度和慢性低强度光照射对RPE细胞的不同影响和机制及其在渗出型AMD发病中的作用还需要进一步研究。

    RPE细胞能够合成和分泌多种细胞因子，其中VEGF和PEDF是目前已知最重要的血管形成促进和抑制因子，两者的协同作用在CNV形成中起关键作用。正常情况下，两者表达处于动态平衡，病理损伤时平衡破坏，血管异常增生[7]。该研究观察到蓝光照射导致RPE细胞分泌VEGF的量上调而PEDF下调，VEGF是一种促血管生成因子，能够增加血管的通透性，从而促进CNV的生成[8]。在糖尿病患者和糖尿病动物模型中观察到过度表达VEGF能够增加视网膜血管的通透性[9-10]。PEDF是血管生成的抑制因子，最初在培养的RPE细胞中发现[11-12]。在增生性糖尿病性视网膜病变患者的玻璃体液中发现PEDF含量下降[13]。血管通透性增加也是新生血管的一个重要致病因素，PEDF对血管周细胞有保护作用，并可通过上调VEGF-C及其受体VEGF-R3的表达，对抗VEGF引起的血管通透性增加[14]。研究结果可能有助于解释白内障手术增加渗出型AMD发生率的原因[3]，可以推断蓝光滤过型IOL同传统紫外线阻挡型IOL相比，可能能够预防和阻止渗出型AMD的发生发展。

    总之，蓝光照射能够损伤含有A2E的RPE细胞，RPE细胞的损伤是光感受器细胞损伤、AMD发生的预兆。本研究推断，蓝光滤过型IOL同传统紫外线吸收型IOL相比，对A2E介导的RPE细胞光损伤有保护作用，能够降低光诱导的ROS和VEGF水平，从而降低渗出型AMD发生的风险。但这一结论尚需进行长期大规模的临床试验研究来证实。

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