【摘要】 目的：研究体外细胞培养中转化生长因子β(transformation growth factor beta, TGFβ)、白细胞介素1 (interleukin1, IL1)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell, HLEC)的增生作用,对白内障术后晶状体后囊浑浊的预防提供依据。
方法：首先进行人晶状体上皮细胞的原代培养,传代培养的晶状体上皮细胞分成各5个实验组,分别加入不同剂量的TGFβ、IL1,设空白对照组,进行3HTDR掺入实验,观察TGFβ、IL1、bFGF对晶状体上皮细胞的作用。
结果：TGFβ、IL1、bFGF对在体外的HLEC增生均有促进作用,并随剂量增加而增强(P<0.05)。
结论：TGFβ、IL1、bFGF在白内障术后的后发性白内障的形成发展过程中起促进作用。
【关键词】 转化生长因子 白细胞介素 碱性成纤维细胞生长因子 晶状体上皮细胞 增生
0引言
白内障是目前致盲的首要原因, 由于对其发病过程中晶状体上皮细胞的病理生理改变不甚了解，至今仍未有有效的治疗药物;白内障囊外摘出或超声乳化联合人工晶状体植入是目前乃至将来相当长一段时间内首选的治疗方案,但由于术后的创伤修复,残留晶状体上皮细胞的增殖、移行、化生, 分泌胶原形成后发性白内障会影响患者术后视力。因此研究后囊浑浊的病因预防及减少或消除晶状体后囊浑浊是提高手术质量的重要课题。200701/10我们研究了转化生长因子β(transformation growth factor beta,TGFβ)、白细胞介素1(interleukin1,IL1)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对一组晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell,HLEC)的影响,探讨了其在后发性白内障形成的作用,为后发性白内障的预防提供实验依据。
1材料和方法
1.1材料
TGFβ、IL1、bFGF(Gibco公司),DMEM培养基(美国Ebico公司),胎牛血清、胰蛋白酶(杭州四季青生物工程材料研究所),3HTDR由中科院原子能研究所提供。
1.2方法
1.2.1晶状体上皮细胞的获取和体外培养
儿童意外死亡3h内摘除眼球，庆大霉素生理盐水冲洗干净，置超净工作台无菌操作，角膜缘剪开去除角膜片，撕除虹膜，将晶状体前囊膜连同赤道部囊膜撕下，Hank.s液冲洗3次，将晶状体的囊膜剪成1mm×1mm大小的植片。用无齿显微镊夹起植片平铺于细胞培养瓶底。加入浓度100mL/L胎牛血清的DMEM培养基0.5mL保持植片湿润，置入37℃、50mL/L CO2培养箱中培养6h。细胞贴壁后加入10mL培养基继续培养，每3d更换培养液1次，倒置显微镜下观察细胞生长情况，直到细胞相互融合并覆盖大部分瓶底（>80%）后按1∶2进行传代。
1.2.2增生测定
第4～6代HLEC计数后(5×104/孔)种入24孔板,24h后改无血清培养24h ,加入不同浓度用无血清培养液稀释。TGFβ和IL1浓度均分别为0.01，0.10，1.00，10.00，100.00μg/L，bFGF的浓度分别为0.01，0.10，1.00，10.00，100.00mg/L每种浓度为4孔,并设空白对照组。24h后加入3HTDR 37kBq/孔培养,PBS充分洗涤去除残留3HTDR ,加入100mL/L的三氯乙酸于4℃固定30min,然后加入0.5mL(1mol/L)的NaOH裂解细胞，每孔加入1mol/L HCL中和，每孔取0.8mL加入到5mL闪烁液中放置过夜，第2d在LS6500液闪烁计数器上测定每分钟脉冲值(cpm)。
统计学处理：计数资料均以±s表示，两组间比较t检验。
2结果
用不同浓度的TGFβ(0.01～100.00μg/L)处理HLEC 24h，加入3HTDR液闪测定TGFβ对HLEC 3HTDR掺入率的影响(表1)；用不同浓度的bFGF(0.01～100.00mg/L)处理HLEC 24h，加入3HTDR液闪测定bFGF对HLEC 3HTDR掺入率的影响(表2)；用不同浓度的IL1(0.01～100.00μg/L)处理HLEC 24h，加入3HTDR液闪测定IL1对HLEC 3HTDR掺入率的影响(表3)。
表1 TGFβ对HLEC DNA合成的影响（略）表2 bFGF对HLEC DNA合成的影响（略）表3 IL1对HLEC DNA合成的影响（略）
3讨论
后囊混浊是目前白内障术后最需要解决的问题，其术后3～5a发生率高达 50%，儿童患者可高达100%，严重影响术后视力。正常晶状体上皮细胞为单层立方形,梭形细胞罕见。后发性白内障时,晶状体上皮细胞可发生斑块状聚集和梭形变化。人眼无论是前囊型还是后囊型白内障以及白内障术后发生的后囊浑浊都会出现上述变化。产生这种改变的原因是手术本身对晶状体是一种创伤的刺激,在修复过程中,可引起晶状体上皮细胞增生为中心的创伤愈合反应,合成和释放各种细胞因子,如:表皮生长因子（EGF）、肿瘤坏死因子(TNFα)等。近来,人们越来越关注转化生长因子(TGFβ)对细胞增生的研究[1]。它广泛存在于许多正常组织中,尤其在血小板贮量丰富,它包括5种异构体,其中TGFβ2主要存在于眼内[2,3],它具有双向功能细胞分裂调节,它一方面对于胚层的细胞具有加速分裂增生,另一方面又具有抑制细胞的作用[4]，TGFβ作用是通过TGFβ受体来实现的。房水、玻璃体、晶状体上皮细胞存在有TGFβ,将大鼠晶状体前囊撕下,体外培养,加入TGFβ后观察,发现晶状体上皮细胞变长,聚集逐渐形成多层。电镜下发现细胞内细胞器减少,RNA聚集,核染色质边缘化,二级溶酶体明显增多,这些现象的出现标志着细胞凋亡。在晶状体培养液中加入TGFβ,3d后晶状体囊膜下开始浑浊,并随着时间推移浑浊逐渐加重。显微镜下可见细胞聚集的斑块和与囊膜平行排列呈多层的梭形细胞,并见囊膜皱缩。Wormstone等[5]的研究发现接受了白内障手术后发生后囊浑浊者其TGFβ的水平明显高于正常组,说明TGFβ可能在后发性白内障的形成过程中起重要作用。
IL1是重要的炎症介质[6,7]，几乎各种有核细胞都能产生,在机体的炎症反应中起重要作用。IL1能促进骨髓释放中性粒细胞,诱导单核细胞和多核细胞趋化浸润到炎症局部(3)。IL1能引起嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒,释放炎症介质[8]。
bFGF作为一种对细胞生长以及分化具有显著作用的多肽, 广泛存在于多种组织中。现已从人脑组垂体、脑、视网膜等多种组织中分离出来。近年来在房水和玻璃体等眼组织中也有发现。Lovicu 等[9]对胚胎期、婴儿期、成年鼠眼组织原位杂交检测bFGFmRNA 发现, 在晶状体上皮细胞及晶状体周围组织(如角膜、睫状体、虹膜、视网膜)均可检测到bFGFmRNA。在豚鼠眼ECCE模型中, 免疫组化示后囊皮质侧bFGF阳性, 对照组(对侧未手术眼)则为阴性[10]；人晶状体前囊膜培养,培养液中检测到bFGF, 并观察到细胞增殖、成纤维样细胞变, 类似白内障囊外摘出术后残余晶状体上皮细胞的改变[11]。由此可见，bFGF与人晶状体上皮的正常生理和后发性白内障的形成密切相关。
本实验利用体外培养细胞技术观察不同浓度TGFβ,IL1,bFGF对儿童晶状体上皮细胞的作用。结果显示作用24h后它们均能促进晶状体上皮细胞增殖和分化以及胶原合成并随剂量增加而增强。后囊浑浊并非某一种细胞因子单独作用的结果,主要是创伤及人工晶状体的异物反应引起多种细胞因子调节平衡的失调进而引起多种细胞进行异常改变的病理结果。因此最小的创伤、最具有生物相容性的人工晶状体以及高效低毒的抑制晶状体上皮细胞药物的开发将成为预防后发性白内障主要手段。
【参考文献】
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9 Lovicu FJ, Iongh RU, McAvoy JW. Expression of FGF1 and FGF2 mRNA during lens morphogenesis, differentiation and growth. Curr Eye Res 1997;16 (3):222230
10 BaldysiakFiqiel A, JonqHesse YD, Lang GK, et al. Octreotide inhibits growth factorinduced and basal proliferation of lens epithelial cells in vitro. J Cataract Refract Surg 2005;31(5):10591064
11 Mansfield KJ, Cerra A, Chamberlain CG. FGF2 counteracts loss of TGFbeta affected cells from rat lens explants: implications for PCO (after cataract). Mol Vis 2004:22(10):521532 |
