作者：姚家奇，刘庆淮，刘肖艺，许志洋，李建民
作者单位：1（210029）中国江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院眼科；2（210029）中国江苏省南京市，南京医科大学细胞生物与遗传学实验室
【摘要】目的：体外观察17AAG对人RPE细胞中VEGFA，VEGFB，VEGFR1，VEGFR2基因表达的调控。方法：体外培养人RPE细胞株加入17AAG并作用不同浓度及时间梯度后,收集细胞,抽提RNA进行反转录。同时根据VEGFA，VEGFB，VEGFR1，VEGFR2的基因序列,设计相应的引物,进行RTPCR，琼脂糖凝胶电泳用于分析引物的特异性，再利用ABI 7300PCR仪和SYBR Green,建立实时荧光PCR反应条件,通过比较Ct进行基因表达的相对定量分析。结果：17AAG可以下调VEGFA，VEGFB和VEGFR1基因的表达，而VEGFR2只有再高浓度17AAG作用时才下调。结论：17AAG可抑制RPE细胞VEGF及其受体基因。
【关键词】 实时荧光定量PCR 17 AAG 视网膜色素上皮细胞 热休克蛋白90 VEGF
0引言
视网膜和脉络膜新生血管(choroidal noevascularization,CNV)常见于湿性年龄相关性黄斑变性（agerelated macular degeneration,AMD）、糖尿病视网膜病变、高度近视黄斑变性等，是导致患者失明的重要原因，而VEGF是导致血管新生的主要原因[1]。虽然Avastin等抗VEGF的一类药物给视网膜和脉络膜新生血管的治疗带来了希望，也取得了一定的治疗效果，但这类药物作用位点单一，治疗效果有限，有一定的并发症。所以抑制视网膜和脉络膜新生血管的药物仍在不断的研发中。17AAG（17丙烯胺基，17去甲氧基格尔德霉素）作为一种新的热休克蛋白90抑制剂，体内、体外实验已经证明其有很强的抗肿瘤作用，而且毒性较小[2]。最近已经进入临床II/III期实验。17AAG不仅可以抑制肿瘤细胞增殖，也可以抑制供应肿瘤的血管形成[3]。17AAG抑制新生血管的机制已经有了一定的研究，初步研究发现其不仅可以抑制VEGF，还可以抑制多种与新生血管相关的分子，如Akt，HIF1α（低氧诱导因子1α）等[4，5]。所以17AAG对于视网膜和脉络膜的新生血管可能有较强的抑制作用。 表1引物序列及扩增产物大小（略）
我们观察17AAG对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial, RPE）细胞中VEGFA，VEGFB，VEGFR1（VEGF受体1），VEGFR2（VEGF受体2）基因表达的影响，从而探索17AAG用于治疗视网膜和脉络膜的新生血管的可能性。
1材料和方法
1.1材料
人RPE细胞株ARPE19细胞（ATCC公司），培养基为DMEM/F12（Hyclone公司）和100mL/L胎牛血清（Gibco公司），加100mg/L青霉素和100mg/L链霉素（Gibco公司），置于37℃含有50mL/L CO2的饱和湿度培养箱中。等细胞处于对数生长期时加入17AAG(Sigma公司)，按给药浓度2，5，10μmol/L将细胞分为3组浓度梯度组，对照组加入等体积DMSO，作用24h后收集4组细胞。另按3μmol/L的17AAG处理时间16，24，48h将细胞分为3组时间梯度组,对照组加入DMSO。
1.2方法
收集处理组和对照组的细胞(约1×107),分别加入1mL Trizol(INVITROGEN公司)，按试剂说明书中的操作步骤进行RNA 提取,加DEPC水，80℃保存。然后通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测抽提RNA 的质量和浓度; 最后用M0MLV反转录酶将RNA反转录成cDNA , 其25μL的反应体系包括RNA 2μL,反转录酶2μL, RNase抑制剂2μL，随机引物( 0.5μg) 1μL,5×buffer 5μL以及2mmol dNTP 6.25μL, 合成的cDNA 置于20℃保存备用。
1.2.1 RTPCR
根据VEGFA，VEGFB，VEGFR1和VEGFR2的mRNA 基因序列, 用PrimerPremier引物设计软件设计4对引物（表1）。然后进行RTPCR，反应条件如下：95℃ 30s变性，55℃ 40s退火，72℃ 90s延伸。循环25次。10g/L琼脂糖凝胶电泳分析引物的特异性。
1.2.2实时荧光定量PCR
应用SYBR Green ABI 7300荧光PCR仪和配套的美国应用生物技术公司的POWER SYBR Green PCR Master Mix进行实时荧光定量PCR。20μL反应体系中包括: cDNA 5μL, 2×POWER SYBRGreen PCR Master Mix 10μL, 上下游引物5μL。反应在专用的96孔板上进行, 用专用的透明膜覆盖于板上,使反应体系密闭于反应孔中, 设置PCR 反应程序: 50℃ 2min 激活UNG酶去除残余的产物污染, 95℃ 10min 激活Taq Gold酶,开始扩增, 95℃ 15s 变性, 60℃ 1min 退火及延伸, 重复40 个循环。在60℃ 1min收集荧光信号，循环结束后执行融解曲线程序。为进一步确定扩增产物的特异性, 反应结束后每个反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
统计学分析: 实时PCR 的结果以Ct值表示。相对定量采用比较Ct法, 根据等式Fold=2△△Ct来计算处理组和对照组之间目的基因的相对表达差异,△△Ct值表示处理组和对照组间的△Ct值差异, 计算结果以两组间目的基因拷贝数的比值, 即Fold值来表示。17AAG处理组和对照组间的目的基因比较采用REST 2005统计软件分析标准误、95%可信区间、P值、变化倍数等[6]。
2结果
2.1 PCR产物分析
琼脂糖凝胶电泳结果显示: RTPCR 反应所得的产物条带为单一条带,并且与预期的扩增产物长度一致（图1）。融解曲线分析显示,5对引物都扩增出了特异性的产物, 其峰值所对应的温度与预期产物的Tm值一致,未出现其它异常波形,波的形状也较锐利。以上结果表明实验中所应用的实时检测系统能分别扩增出各自特异性的产物。
2.2 17AAG处理
运用上述建立的实时荧光定量PCR方法,分析17AAG对人RPE细胞基因表达的影响作用,所有样本均重复3次检测。结果表明，与对照组相比,低浓度的17AAG只能抑制RPE细胞中的VEGFA，随着17AAG浓度的增加，VEGFB和VEGFR1的表达水平也下调,呈剂量依赖型。其中VEGFA下调较明显,而VEGFR2只有在高浓度17AAG时才能被抑制（图2A）。与对照组相比,时间梯度组中的VEGFA，VEGFB和VEGFR1的表达水平下调,呈时间依赖型。而VEGFA在48h时已有部分恢复（图2B）。
3讨论
VEGF是目前已知在视网膜脉络膜新生血管生成的微环境中最重要的促血管生成因子之一,大量研究证实，VEGF在AMD、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变等病理性新生血管形成过程中起着关键的作用[1]。VEGF既能破坏正常眼的血视网膜屏障,造成视网膜的渗出、出血和水肿；也能诱导血管内皮细胞的分裂、增生,并促使内皮细胞迁移,增强了毛细血管通透性,使血浆外渗,有利于新生血管以出芽的方式促成大量血管形成,还可以使非内皮细胞分泌VEGF,再通过旁分泌机制作用于其他细胞。此外,VEGF还可增加视网膜血管内皮细胞间黏附分子的蛋白质水平,促进白细胞瘀滞,破坏血管壁,激活血小板,引起血流缓慢和血栓形成,导致局部视网膜缺血缺氧,最终形成新生血管[7，8]。灵长类及转基因动物实验中也已证实其促CNV发生的作用。用可溶性VEGFR1或VEGF抗体抑制VEGF可减少CNV的形成和发展。因此,针对VEGF的药物治疗成为当前新生血管研究的重点[9]。在CNV患者的房水、玻璃体、RPE、基底膜中均可检测到VEGF高表达[10]。其中RPE细胞是VEGF的重要来源，RPE中VEGF的过表达导致CNV形成[9]。Akt也是血管新生信号通路中的关键分子，我们前期实验证实17AAG也可以抑制其表达[6]。我们证实17AAG对RPE细胞中的VEGF及其受体有抑制作用，尤其对VEGFA的抑制作用较强。这些结果说明，17AAG可能对于视网膜脉络膜新生血管疾病的治疗很有价值。
【参考文献】
1 Penn JS, Madan A, Caldwell RB, et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Prog Retin Eye Res2008;27(4):331371
2姜新宇,陈道桢,刘璐.17丙烯胺基17去甲氧基格尔德霉素研究进展.国际肿瘤学杂志2006;33(9):646650
3 Powers MV, Workman P. Targeting of multiple signalling pathways by heat shock protein 90 molecular chaperone inhibitors. Endocr Relat Cancer 2006;13 Suppl 1:S125135
4 Sanderson S, Valenti M, Gowan S, et al. Benzoquinone ansamycin heat shock protein 90 inhibitors modulate multiple functions required for tumor angiogenesis. Mol Cancer Ther2006;5(3):522532
5 Lang SA, Klein D, Moser C, et al. Inhibition of heat shock protein 90 impairs epidermal growth factor mediated signaling in gastric cancer cells and reduces tumor growth and vascularization in vivo. Mol Cancer Ther 2007;6(3):11231132
6许志洋,姚家奇,刘庆淮,等.实时荧光PCR检测17AAG对人RPE细胞Akt等基因表达的调控.国际眼科杂志 2008;8(9):17921794
7 Suhardja A, Hoffman H. Role of growth factors and their receptors in proliferation of microvascular endothelial cell. Microsc Res Tech2003;60(1): 7075
8 Joussen AM, Poulaki V, Qin W, et al. Retinal vascular endothelial growth factor induces intercellular adhesion molecule1 and endothelial nitic oxidesynthase expression and initiates early diabetic retinal leukocyte adhesion in vivo. Am J Pathol2002;160(2):501509
9许建华,李若溪,张薇,等.眼内新生血管发生机制的研究进展.国际眼科杂志2008;8(12):24962498
10 Schlingemann RO. Role of growth factors and the wound healing response in agerelated macular degeneration. Graefe Arch Clin Exp Ophthalmol 2004;242(1):91101
|
