作者：宫媛媛,宋毅,张红梅,吴星伟
作者单位：（200080）中国上海市，上海交通大学附属第一人民医院眼科
【摘要】目的：观察中药复方黄斑颗粒对大鼠视网膜光损伤细胞凋亡的影响。方法：雄性SD大鼠21只分为给药组、对照组和正常组，光损伤前10d用中药复方黄斑颗粒灌胃，对照组用等体积蒸馏水灌胃，正常对照组正常饲养。光损伤白色荧光灯平均光照强度2800Lux,暗适应24h后，散瞳光照5h后置暗环境饲养，光损伤后继续给药给水，3d后取眼球做石蜡包埋切片，用TUNEL方法进行染色，同时留取眼球进行电镜观察超微形态改变。结果：正常组视网膜结构规整，几乎无TUNEL染色阳性细胞，对照组外核层有大量黄色阳性细胞，结构紊乱，给药组散在少量阳性细胞；电镜下观察可见对照组色素上皮细胞微绒毛消失，光感受器外段排列紊乱，外核层有较多的固缩凋亡细胞核，而给药组则散在少量凋亡细胞。结论：中药黄斑颗粒可能通过对抗细胞凋亡而对大鼠视网膜光损伤起到保护作用。
【关键词】 黄斑颗粒 光损伤 视网膜变性 凋亡检测 超微结构 大鼠
0引言
视网膜光损伤是由视紫红质介导的氧化应激过程，过量的光线照射可以诱导白化大鼠视网膜光感受器变性[13]，细胞凋亡是主要的表现方式[4,5]。许多视网膜变性类疾病与细胞凋亡关系密切，如视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性是临床上常见的可致盲眼病，其发展可能直接或间接与光损伤有关[6]。我们在中药复方黄斑颗粒的前期研究中[7]已显示其对视网膜光损伤在形态和功能上有明显的保护作用。为进一步研究该方法是否有对抗凋亡的效应，我们通过相同模型制作方法，运用相关的凋亡检测方法，观察到它对光诱导视网膜损伤后凋亡的影响如下。
1材料和方法
1.1材料
雄性SD大鼠21只，体质量190～210g，由中国科学院上海实验动物中心提供。采用随机数字方法将大鼠分为治疗组（喂药）、对照组（喂蒸馏水）和正常组各7只。黄斑颗粒冲剂（沪药制字Z05050795）。TUNEL试剂盒（deadendTM fluorometric TUNEL system）由美国Promega公司提供。
1.2方法
动物模型制作方法以及给药方法参见文献[7]。在光照后3d用100g/L水合氯醛过量处死大鼠，迅速于角膜缘12∶00处缝线做标记，每组各取4只大鼠眼球固定于40g/L中性甲醛固定液中，24h后梯度浓度乙醇脱水、石蜡包埋，过缝线与视神经做矢状切片（4μm）。取各组石蜡切片,进行凋亡感光细胞核的末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)。按照说明书进行常规脱蜡、水化、蛋白酶K孵育后滴加TUNEL反应混合液，最后用碘化丙啶（PI）染核。于激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss 510,德国Zeiss公司)下观察并采用Zeiss 4.6软件进行同步图像采集。视网膜组织中的黄色荧光着色为阳性凋亡感光细胞核。图像采集部位为视乳头上方2mm处。同时，于角膜12∶00处缝线做标记后，取每组各3只大鼠眼球固定于25g/L戊二醛固定液中，24h后选取视神经上方2mm处视网膜全层组织1mm×1mm依次进行锇酸固定、脱水、浸透和包埋处理，LKB超薄切片机切片，枸橼酸铅染色，JEM1200EX型透射电子显微镜观察拍片（复旦大学医学院电镜室提供）。
2结果
2.1 TUNEL检测
正常对照组大鼠视网膜外核层感光细胞核TUNEL染色均为阴性（绿色为TUNEL染色，红色为PI核染色，黄色为重叠部分），无黄色着染；光照后3d，对照组视网膜外核层可见大量黄色着染的TUNEL阳性细胞核，以上方视网膜最为显著；而给药组视网膜仅见散在的少量黄色TUNEL阳性细胞核（图1）。
2.2 电镜观察
正常组色素上皮细胞完整，感受器外段及外核层排列规整，光照后3d，对照组视网膜色素上皮细胞欠完整，微绒毛消失，光感受器外段紊乱，断裂甚至消失，外核层细胞核固缩,细胞间隙增宽,呈凋亡形态改变；而给药组形态相对完好,感受器外段排列相对规整，外核层有少量空泡变，散在固缩的凋亡细胞核（图2）。
3 讨论
视网膜光损伤模型是一种氧化应激模型，与自由基和脂质过氧化有关，属于一种光化学损伤[5]。光照射视网膜引起组织发生过氧化反应,光感受细胞的外节是体内含长链不饱和脂肪酸最高的组织,这些长链不饱和脂肪酸具有易受自由基攻击的亚甲基结构,对过氧化物极敏感,易与OH反应形成脂质自由基,并攻击其他不饱和脂肪酸引起连锁反应,使核膜、盘膜、线粒体和内质网的脂质发生过氧化,最终导致这些生物膜溶解和破坏,造成视网膜光损伤。视网膜光损伤后以凋亡为主要表现,细胞凋亡的主要特征是染色质聚集，分块，位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽方式形成凋亡小体。Hao等[4]发现视网膜光损伤后感光细胞的凋亡至少有两个途径，强光通过激活视紫红质蛋白引发凋亡，而低强度光则主要依赖激活转导信号蛋白。不论是哪种途径，细胞凋亡会出现线粒体膜电位的丧失，细胞膜PS（磷脂酰丝氨酸）的外翻，细胞核凝缩和断裂。TUNEL是一种原位凋亡检测方法，较为灵敏，我们发现大鼠视网膜光损伤后3d，即可检测出较多的TUNEL阳性细胞，而给药组阳性细胞明显少于对照组。然而，理论上TUNEL阳性并不都代表细胞凋亡，也可能有坏死，因而本研究同时进行了电镜超微结构的观察，结果表明在对照组的光感受器细胞层有较多核固缩的细胞，细胞膜尚完整，表现出凋亡的形态特征，而给药组则少见。光损伤模型的建立使得对这一病变的防治有了较深入的研究与探讨[8,9]。视网膜感光细胞的抗氧化应激能力主要依赖于内源性抗氧化系统和视网膜色素上皮以及视网膜胶质细胞分泌的神经营养因子[10,11]，但如果自由基生成量超过了机体清除能力时，细胞将受到损害。研究表明外源性抗氧化剂对光损伤后视网膜具有保护作用[12]。黄斑颗粒具有温阳补肾益肝，生精养血通络之功效，其中不乏抗氧化以及改善微循环的单味成分[13]，但复方制剂成分较复杂，可能是通过清除自由基抗氧化和抗凋亡而发挥作用，其具体机制尚需要进一步探讨。一些严重的眼底病变如视网膜色素变性、老年性黄斑变性，共同的特征是有光感受器细胞的凋亡变性，目前尚缺乏理想的预防治疗手段。随着现代技术的发展，中医药治疗这类疾病的疗效以及其作用机制正不断得以研究[7,14]，某些单味或复方制剂具有较好的抗炎，改善微循环，提高免疫力的功效。我们的研究结果表明复方黄斑颗粒能有效抑制大鼠视网膜光损伤后感光细胞的凋亡，同时在一定程度上保存视网膜细胞的形态，延缓病变的进展，为临床治疗视网膜变性类疾病提供了部分客观依据，显示了传统中药在治疗这类疾病具有较好的前景，对预防和治疗视网膜变性类疾病，以及医源性光损伤具有一定的临床意义。
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